Método para disminuir la floculación de una solución de células de E.

coli alteradas, que a) disminuir el pH de una solución que contiene las células de E. coli completas que expresan una proteína diana heteróloga hasta un pH que es 4-5 o no superior a 4, donde el pH de la solución que contiene las células de E. coli completas disminuye antes de alterar las células; b) añadir por lo menos un potenciador de la solubilidad a la solución que contiene células de E. coli; y c) alterar las células para liberar la proteína diana heteróloga en la solución

Antecedentes de la invención

Los procesos biotecnológicos para producir productos proteicos farmacéuticos o de diagnóstico utilizan en general etapas de extracción y purificación para obtener productos de interés a partir de un conjunto de fuentes. Las fuentes de las proteínas pueden incluir, por ejemplo, fluidos de cultivos de bacterias, levadura, células de mamífero y 5 extractos de tejidos naturales

En general, las etapas de extracción y purificación son numerosas y comprenden varias técnicas. El tipo de producto a producir, su uso previsto, y otros factores influyen en qué etapas son más apropiadas, qué grado de purificación es beneficioso, y cómo se puede llevar a cabo la purificación. En general, cuanto mayor es la pureza de producto deseada, más etapas se utilizarán en el proceso. 10

Los protocolos estándar de purificación de proteínas empiezan en general con la alteración de células y una etapa de clarificación para eliminar la debris celular y/o tisular de la proteína diana. Una manera habitual de clarificar una solución es mediante centrifugación. La eficacia de una etapa de centrifugación depende del tamaño de partícula, la diferencia de densidad entre partículas y líquido circundante, viscosidad de la alimentación, y similares. Para soluciones obtenidas a partir de células pequeñas, tales como E. coli, el tamaño de partícula pequeño y la viscosidad elevada 15 reducen la capacidad de alimentación durante la centrifugación y pueden interferir con el proceso de clarificación. De este modo, se recomienda a menudo combinar una etapa de centrifugación con microfiltración. Aunque la microfiltración puede aliviar algunos de los problemas que se encuentran, la contaminación de las membranas de microfiltración también pueden ser un problema adicional.

Cada etapa adicional en un proceso de purificación de proteínas afecta tanto al coste de la purificación como al 20 rendimiento global. Por consiguiente, los fabricantes buscan obtener la pureza de producto deseada de la forma más económica. Una manera de disminuir el coste de producción es reducir el número de etapas en un proceso de purificación. Alternativamente, las etapas en los procesos existentes se pueden modificar o aumentar para reducir la pérdida de proteína en cada etapa.

Los protocolos para la purificación de proteínas son bien conocidos y accesibles a través de internet (por ejemplo 25 EMBL's Protein Expression and Purification Core Facility http://www.pepcore.embl.de). Un método para hacer más eficiente el proceso de purificación de proteínas es, por ejemplo, lisando células en un tampón que tiene un pH apropiado para el procesado posterior (por ejemplo, WO96/34622 o Nye et al, Mol. Immunol. 1995, 1131).

Un método que incrementa el rendimiento mediante la eliminación de etapas del proceso es la cromatografía de lecho expandido (“EBC”). La EBC es una técnica que utiliza un absorbente en un lecho fluidizado estable. Cuando se 30 utiliza la EBC para purificar proteínas a partir de soluciones que contienen debris celular y/o debris tisular, la centrifugación previa no es necesaria. Aunque la utilización de EBC elimina una etapa del proceso, tanto la pérdida de producto como las desventajas del procesado pueden aparecer con EBC. El aparato de EBC mantiene un adsorbente en la columna con una frita, y se puede contaminar por la debris celular en la solución aplicada a la columna. La contaminación de la frita puede disminuir el rendimiento del producto, aumentar los tiempos de procesado y, en casos 35 extremos, dejar el proceso inutilizable.

Por lo tanto, aun existe la necesidad de procesos y métodos que pueden realizar purificaciones de proteínas con una pureza más elevada a un coste menor.

Descripción resumida de la invención

La invención es tal como se define en las reivindicaciones. 40

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es un gráfico que compara la contrapresión (psi) en función del tiempo para homogenatos acondicionados en la post-homogenización y la pre-homogenización durante EBC.

La figura 2 es una fotografía que compara la contaminación de una frita sometida a homogenatos acondicionados en la 45 post-homogenización y la pre-homogenización

La figura 3 es una fotografía que compara pélets de soluciones centrifugadas acondicionados en la post-homogenización y la pre-homogenización.

La figura 4 es un gráfico de la velocidad de flujo (cm/h) para EBC de un homogenato acondicionado en la post-homogenización, un homogenato acondicionado en la pre-homogenización y una solución tampón a un pH que varía de 4,0 a 6,5.

La figura 5 es una fotografía de las interacciones entre una resina de EBC y el homogenato con MgSO4 30 mM y 45 mM. 5

La figura 6 es un gráfico de la concentración (mg/mL) de Fab'2 en soluciones con concentraciones variables de MgSO4 y polietilenimina.

La figura 7 es un gráfico de barras de la capacidad (g Apo2L/L resina) de la resina para la proteína Apo2L a varias concentraciones de MgSO4.

La figura 8 es un gel SDS-PAGE de homogenatos de Factor Anti-Tisular a pH de 4 a 7 que incluye un potenciador de la 10 solubilidad o varias sales.

Descripción detallada de la invención

Tal como se utiliza aquí, el término “aproximadamente”, el término “aproximadamente” se aplica a todos los valores numéricos, estén indicados o no explícitamente. El término “aproximadamente” se refiere en general a un intervalo de números que se considerarías equivalentes al valor citado (es decir, que tiene la misma función o 15 resultado). En muchos casos, el término “aproximadamente” puede incluir números que están redondeados hasta la cifra significativa más próxima.

Los procesos de la presente invención están dirigidos en general a la extracción de proteínas diana heterólogas de células de E. coli. Tal como se utiliza aquí, el término “proteína diana heteróloga” se refiere a una proteína recombinante que no se expresa normalmente por la célula, tejido o especie huésped. Entre los ejemplos de proteínas 20 heterólogas se incluyen, pero sin limitación, Apo2L/Trail, Fab VEGF, y anticuerpo Anti-Factor tisular, producidos en E. coli. Se entiende en general que un proceso para extraer una proteína diana heteróloga dará lugar a un producto proteico que está enriquecido en la proteína diana heteróloga, pero también puede contener otros componentes. Entre los ejemplos de dichos otros componentes se incluyen, pero sin limitación, proteínas normalmente expresadas por la célula o el tejido huésped, debris celular o caldo celular, por ejemplo. 25

Tal como se utiliza aquí, el término “biomasa” se refiere a por lo menos la debris celular. Las “interacciones biomasa-biomasa” se refieren en general a las interacciones entre la debris celular que pueden conducir a la floculación. Las “interacciones biomasa-resina” se refieren en general a las interacciones entre la debris celular y la resina de la columna de EBC que pueden provocar que la debris celular se una a la columna y pueda finalmente contribuir a la contaminación de la columna. 30

Tal como se utiliza aquí, la frase “alterar las células” se refiere a cualquier proceso que libera el contenido de la célula a la solución que contiene la célula. Entre los ejemplos de métodos de “alteración de las células” se incluyen, pero sin limitación, la homogenización, lisozima, sonicación, congelación-descongelación, Presión Francesa, y otros métodos de alteración celular químicos mecánicos o físicos. La etapa del proceso de “alteración de las células” se puede llevar a cabo con una o más etapas, por ejemplo, múltiples etapas que utilizan una homogenización de 4 pasos. 35

Tal como se utiliza aquí, la etapa de “separación de la debris celular de la proteína liberada” se puede llevar a cabo mediante un conjunto de técnicas conocidas. Entre los ejemplos de dichas técnicas se incluyen, pero sin limitación, centrifugación, microfiltración, cromatografía de lecho empaquetado ("PBC"), cromatografía de lecho expandido ("EBC"), u otros tipos de cromatografía en columna, por ejemplo. La etapa de “separación de la debris celular de la proteína liberada” no requiere una...

1. Método para disminuir la floculación de una solución de células de E. coli alteradas, que comprende,

a) disminuir el pH de una solución que contiene las células de E. coli completas que expresan una proteína diana heteróloga hasta un pH que es 4-5 o no superior a 4, donde el pH de la solución que contiene las células 5 de E. coli completas disminuye antes de alterar las células;

b) añadir por lo menos un potenciador de la solubilidad a la solución que contiene células de E. coli; y

c) alterar las células para liberar la proteína diana heteróloga en la solución.

2. Método para extraer una proteína diana de las células de E. coli, que comprende,

a) realizar un método según la reivindicación 1; y 10

b) separar la debris celular de la proteína liberada para obtener un producto proteico enriquecido en proteína diana heteróloga.

3. Proceso según la reivindicación 1 o la reivindicación 3, donde el pH disminuye hasta un pH de 4 a 5.

4. Proceso según la reivindicación 3, donde el pH disminuye hasta un pH de 4 a 4,5. 15

5. Proceso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde el pH disminuye hasta aproximadamente pH 2.

6. Proceso según la reivindicación 2, donde dicha separación comprende centrifugación.

7. Proceso según la reivindicación 6, que comprende además la purificación de la proteína diana heteróloga del producto proteico. 20

8. Proceso según la reivindicación 7, donde dicha purificación comprende una cromatografía en columna.

9. Proceso según la reivindicación 8, donde dicha cromatografía en columna es una cromatografía de lecho expandido.

10. Proceso según la reivindicación 2, donde se añade por lo menos un potenciador de la solubilidad a 25 la solución antes de dicha disminución del pH.

11. Proceso según la reivindicación 2, donde se añade por lo menos un potenciador de la solubilidad a la solución antes o simultáneamente con dicha disminución del pH.

12. Proceso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde por lo menos un potenciador de solubilidad comprende un catión divalente. 30

13. Proceso según la reivindicación 12, donde el catión divalente comprende magnesio o calcio.

14. Proceso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde por lo menos un potenciador de la solubilidad es polietilenimina (PEI).

15. Proceso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde por lo menos un potenciador de la solubilidad comprende un catión divalente y PEI. 35

16. Proceso según la reivindicación 12, donde el catión divalente se añade hasta una concentración de 10 mM a 150 mM.

17. Proceso según la reivindicación 14, donde la PEI se añade hasta una concentración del 0,2% a 0,3% vol/vol de una solución al 50% peso/vol.

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