PROCEDIMIENTOS DE DIAGNÓSTICO QUE IMPLICAN LA DETERMINACIÓN DEL NÚMERO DE COPIAS DE GENES Y DE SNP EN EL GRUPO DE GENES FC RII/FC RIII Y SONDAS PARA UTILIZAR EN DICHOS PROCEDIMIENTOS PARA DETECTAR LA SUSCEPTIBILIDAD A ENFERMEDADES AUTOINMUNES Y LA EFICACIA DE SU TRATAMIENTO.

Procedimiento para determinar si un individuo está predispuesto a desarrollar la enfermedad de Kawasaki (KD) o Púrpura Trombocitopénica Idiopática (ITP),

que comprende: - determinar en una muestra aislada de dicho individuo la cantidad de los genes en el grupo de genes FcγRII/FcγRIII, comprendiendo dicho grupo de genes los genes FCGR2C, FCGR3A, FCGR2A y FCGR3B, que codifican un FcγR activador y FCGR2B que codifica un FcγR inhibidor, en el que la determinación de la cantidad de dichos genes comprende, como mínimo, determinar la presencia del gen FCGR2C-ORF, opcionalmente además comprende detectar un polimorfismo de nucleótido simple (SNP) en un exón, intrón y/o región promotora, como mínimo, de un gen seleccionado del grupo que comprende FCGR2C, FCGR2B, FCGR2A, FCGR3A y FCGR3B; y - correlacionar dicha cantidad con la cantidad observada en una población sana; en el que una cantidad mayor de los genes que codifican un FcγR activador, y/o una cantidad menor del gen que codifica un FcγR inhibidor es indicativa de que tiene mayor probabilidad de desarrollar KD o ITP.

Procedimientos de diagnóstico que implican la determinación del número de copias de genes y de SNP en el grupo de genes FC RII/FC RIII y sondas para utilizar en dichos procedimientos para detectar la susceptibilidad a enfermedades autoinmunes y la eficacia de su tratamiento La presente invención se refiere a los sectores de la inmunología y la medicina molecular. En particular, se refiere a procedimientos de diagnóstico que implican la determinación de la cantidad de genes intactos del grupo de genes FcγRII/FcγRIII y la utilización de los mismos en tratamiento de enfermedades, por ejemplo, para predecir si un individuo está predispuesto a contraer una enfermedad o para predecir la respuesta terapéutica de un paciente individual. También se refiere a las sondas y construcciones de ácidos nucleicos para utilizar en dichos procedimientos.

La secuenciación del genoma humano ha dado lugar a muchos avances técnicos y ha estimulado el descubrimiento de varios hitos de la genómica. Un área es el desarrollo de un amplio conjunto de marcadores polimórficos para el mapeo de genes. La forma más común de la variación de la secuencia de ADN es un polimorfismo de nucleótido simple (SNP) , pero, además, existen polimorfismos de repetición de microsatélites y polimorfismos de inserción/deleción. Mientras que los microsatélites y SNP han sido muy bien caracterizados en términos de su localización genómica y sus frecuencias en distintas poblaciones, los polimorfismos de inserción/deleción no están tan bien caracterizados. Trabajos recientes (véase, por ejemplo, Sebat J. y otros, Large-scale copy number polymorphism (CNP) in the human genome. Science 2004, 305: 525-528) describen la identificación de grandes (de varias kilobases a megabases) deleciones y duplicaciones de fragmentos de ADN cuando se compararon genomas de individuos normales. La identificación y caracterización de los polimorfismos de número de copias (CNP) muestran que, además de diferencias de un solo nucleótido, los genomas de individuos no relacionados tienen grandes regiones de miles hasta millones de nucleótidos que son diferentes.

Desde una perspectiva funcional, las diferencias del número de copias del gen puede contribuir a la variación en la expresión génica. Los CNP de regiones de codificación y reguladoras es probable que puedan afectar la expresión de genes en los niveles de transcrito y/o proteína. Estudios de expresión génica han demostrado que diferencias sutiles en los niveles de expresión de genes tienen consecuencias significativas. Por ejemplo, el polimorfismo de número de copias del grupo de genes de las defensinas probablemente explica la variación natural en el nivel de expresión de DEFB4 que, a su vez, podrían explicar las diferencias individuales en la defensa inmune (Linzmeier y otros, Genomics 2005; 86:423-30) . Por otra parte, González y otros (Science. 2005; 307:1434-40) informaron que la posesión de un número de copias de CCL3L1 menor que el promedio de la población se asocia con una susceptibilidad marcadamente aumentada del VIH/ síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) . Cappuzzo y otros (J. Natl Cancer Inst. 2005; 97:643-55) dieron a conocer que pacientes con cáncer de pulmón no de células pequeñas avanzado cuyas células tumorales contienen copias adicionales del gen del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) pueden ser más propensas a responder al medicamento gefitinib (Iressa) , y sugirieron que este elevado número de copias de genes puede ser una manera eficaz de determinar la eficacia de gefitinib.

Por lo tanto, se está acumulando evidencia de que los polimorfismos de número de copias (CNP) y su efecto global sobre la expresión de genes contribuye de manera significativa a la variación que subyace en las diferencias individuales en la predisposición a enfermedades complejas.

Es un objetivo de la presente invención dar a conocer nuevos marcadores de diagnóstico para enfermedades autoinmunes, en particular, marcadores que se pueden utilizar para predecir si a) el individuo está predispuesto para desarrollar una enfermedad autoinmune y, b) una vez que el individuo ha sido diagnosticado con una enfermedad autoinmune, si el individuo individual seguirá un curso severo o benigno de la enfermedad o si la enfermedad se desarrollará en una forma crónica y, c) si el individuo individual diagnosticado con una enfermedad autoinmune responderá a ciertos tipos de terapia.

Estos objetivos se cumplen por el descubrimiento que los genes del grupo de genes FcγRII/FcγRIII se utilizan de forma adecuada como marcadores de pronóstico para las principales enfermedades autoinmunes, así como para predecir el desarrollo de la enfermedad y/o la respuesta a la terapia con inmunoglobulina intravenosa (IgIV) . Tal como se describe en detalle más adelante, los inventores se dedicaron a medir el número de copias y los SNP de genes en el grupo de genes FcγRII y FcγRIII humanos en el cromosoma 1q21-23. Mediante la utilización de cebadores diseñados para hibridar en las regiones de los genes FcγRII y RIII que son específicos para los genes, se determinó el número de copias de los genes FcγRII y FcγRIII en individuos humanos que sufren de una enfermedad autoinflamatoria. Más específicamente, los datos obtenidos de pacientes que sufren de una enfermedad autoinflamatoria en la infancia, la denominada enfermedad de Kawasaki, y de pacientes que tienen púrpura trombocitopénica inmune (ITP) se compararon con los individuos de control.

La enfermedad de Kawasaki es un síndrome febril agudo en la infancia, que se caracteriza por una vasculitis principalmente de las arterias de tamaño mediano. Puesto que no hay pruebas específicas para diagnosticar la enfermedad, el diagnóstico se hace mediante criterios clínicos. En esta forma de vasculitis pediátrica, se utilizan altas dosis de infusiones de inmunoglobulina intravenosa como tratamiento estándar para prevenir la lesión de la arteria coronaria. Tal como se da a conocer en el presente documento, se encontró que los pacientes con la enfermedad de Kawasaki como promedio tienen una cantidad diferente del número habitual de dos genes FCGR2B por genoma, cuando se normalizaron en relación a varios genes de referencia (CYBB como gen ligado al cromosoma X, SRY como gen ligado al cromosoma Y y ALB que codifica la proteína plasmática albúmina de suero humana, como un gen autosómico) . Las variaciones del número de copias del gen en los pacientes e individuos de control se muestran en los ejemplos más adelante. Burnea y otros (Genes Immun. 2005; 6 (5) : 438-44) dan a conocer la asociación de la variación genética en el gen de IL-4 o regiones unidas a éste y la susceptibilidad y patogénesis de la enfermedad de Kawasaki.

La ITP es una enfermedad caracterizada por trombocitopenia con líneas celulares normales de otra manera y sin otra explicación para la trombocitopenia aislada. La destrucción de las plaquetas sensibilizadas por anticuerpos por las células fagocíticas que contienen FcγR en el sistema retículoendotelial juega un papel importante, aunque la patofisiología exacta de este trastorno autoinmune no se conoce de forma precisa. El papel de los preceptores de Fc se ha subrayado por el hecho que el tratamiento con inmunoglobulina intravenosa (IVIg) , a través del bloqueo de los receptores de Fc para IgG y la esplenectomía (extracción del órgano que destruye las plaquetas) son opciones de tratamiento eficaces. Dijstolbloem y otros (Trends Immunol. 2001; 22 (9) : 510-6) describen el tratamiento de enfermedades autoinmunes relacionadas con la desregulación de receptores de Fcγ, entre las que está púrpura trombocitopenia idiopática, con Ig intravenosa (IVIg) .

Estudios anteriores relacionados con polimorfismos en el grupo de genes FCGR en pacientes con ITP muestran resultados contradictorios. En un estudio que involucró 116 pacientes con ITP, los presentes inventores encontraron una variación aumentada en el grupo de genes FCGR2 y FCGR3 en pacientes caucásicos en comparación con pacientes caucásicos sanos de control. Por ejemplo, un 82% de la población sana es homocigótica para un SNP que convierte una glutamina en el marco de lectura abierto (ORF) de FGCR2C en un codón de parada, haciendo de FCGR2 un seudogén no expresado. El resto (18%) de la población sana contiene FCGR2-ORF. Por el contrario, se encontró que el 36% de los pacientes con ITP portan, como mínimo, un alelo FCGR2-ORF, que da como resultado la expresión de un PcγRIIc funcionalmente activo. Además, se observó una diferencia significativa en la frecuencia genotípica y alélica del polimorfismo promotor... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para determinar si un individuo está predispuesto a desarrollar la enfermedad de Kawasaki (KD) o Púrpura Trombocitopénica Idiopática (ITP) , que comprende:

- determinar en una muestra aislada de dicho individuo la cantidad de los genes en el grupo de genes FcγRII/FcγRIII, comprendiendo dicho grupo de genes los genes FCGR2C, FCGR3A, FCGR2A y FCGR3B, que codifican un FcγR activador y FCGR2B que codifica un FcγR inhibidor, en el que la determinación de la cantidad de dichos genes comprende, como mínimo, determinar la presencia del gen FCGR2C-ORF, opcionalmente además comprende detectar un polimorfismo de nucleótido simple (SNP) en un exón, intrón y/o región promotora, como mínimo, de un gen seleccionado del grupo que comprende FCGR2C, FCGR2B, FCGR2A, FCGR3A y FCGR3B;y

- correlacionar dicha cantidad con la cantidad observada en una población sana; en el que una cantidad mayor de los genes que codifican un FcγR activador, y/o una cantidad menor del gen que codifica un FcγR inhibidor es indicativa de que tiene mayor probabilidad de desarrollar KD o ITP.

2. Procedimiento, según la reivindicación 1, que comprende detectar la cantidad del gen FCGR2C-ORF en combinación con la determinación de las frecuencias de alelos del SNP FCGR3A para la variante o variantes FcγRIIIa-158F y/o FcγRIIIa-158V, y/o determinar la frecuencia de alelos para el polimorfismo promotor de FCGR2B o C –386G/C.

3. Procedimiento, según la reivindicación 1, que comprende detectar la cantidad del gen FCGR2C-ORF en combinación con la detección de la cantidad del gen FCGR3A.

4. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la determinación del número de copias comprende correlacionar la cantidad de genes dianas con la cantidad de un gen de referencia en una muestra de ácido nucleico de dicho individuo, en el que el gen de referencia es el gen CYBB o un ortólogo del mismo.

5. Procedimiento, según la reivindicación 4, en el que dicho gen de referencia CYBB se detecta utilizando cebadores específicos de CYBB en el exón 8 o alrededor del mismo.

6. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 – 5, que comprende la detección, como mínimo, de un SNP en la región promotora del gen FCGR2B/C, y/o la detección, como mínimo, de un SNP en el gen FCGR3A, preferentemente aquellas que resulten en las variantes FcγRIIIa-158F y/o FcγRIIIa-158V.

7. Procedimiento, según la reivindicación 6, en el que dicho, como mínimo, un SNP en la región promotora del gen FCGR2B/C es un SNP en el nucleótido –386 y/o –120, preferentemente haplotipo 2B.1 (-386C/-120A) .

8. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende la utilización de tecnología de amplificación de sonda dependiente de ligación múltiple (MLPA) .

9. Procedimiento, según la reivindicación 8, utilizando una sonda MLPA capaz de detectar una secuencia diana según cualquiera de las SEQ ID NO: 15 a 52, preferentemente una sonda FCGR2 capaz de detectar una secuencia diana según cualquiera de las SEQ ID NO: 15 a 33 y/o una sonda FCGR3 capaz de detectar una secuencia diana según cualquiera de las SEQ ID NO: 34 a 41.