ANTAGONISTAS DE INTERACCION DE FACTOR VIII CON UNA PROTEINA RELACIONADA CON EL RECEPTOR DE LIPOPROTEINAS DE BAJA DENSIDAD.

Uso de un anticuerpo de unión a Factor VIII para la preparación de una composición farmacéutica para disminuir la degradación de Factor VIII y/o prolongar la vida media de Factor VIII en un fluido biológico,

en el que el anticuerpo de unión a Factor VIII comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID No: 17 y 19 de las cadenas pesada y ligera de KM41 o las secuencias de aminoácidos SEQ ID No: 21 y 23 de las cadenas pesada y ligera de KM33

Antagonistas de interacción de factor VIII con una proteína relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad.

La presente invención se refiere al uso de anticuerpos generados contra el Factor VIII y la inhibición de la interacción del factor VIII con LRP. Además, la presente invención se refiere a un método para inhibir la interacción de LRP con el Factor VIII, así como a un método para disminuir la degradación del Factor VIII y/o prolongar la vida media del Factor VIII en un fluido biológico y/o a un método para tratar pacientes que sufren de un trastorno de la coagulación de la sangre, especialmente Hemofilia A. La presente invención además se refiere a una composición farmacéutica útil para disminuir la degradación del Factor VIII en un fluido biológico, la inhibición de la interacción del Factor VIII con LRP y/o la prolongación de la vida media del Factor VIII en un fluido biológico para el tratamiento de un trastorno de la coagulación de la sangre, especialmente Hemofilia A.

La coagulación de la sangre implica una combinación de diferentes rutas de reacción hemostáticas que finalmente conllevan a la formación de un trombo. Los trombos son coágulos de componentes de la sangre en la superficie de las paredes de los vasos y principalmente consisten en plaquetas de la sangre agregadas y fibrina reticulada insoluble. La formación de fibrina se induce mediante la proteólisis limitada de fibrinógeno mediante la enzima coagulante trombina. Esta enzima es el producto final de una cascada de coagulación, que es una secuencia de activaciones de zimógeno que tienen lugar en la superficie de las plaquetas y leucocitos activados y una multitud de células vasculares (ver, por ejemplo, K. G. Mann y otros, Blood, 1990, Vol. 76, páginas 1-16).

Una etapa clave en esta cascada de coagulación es la activación del Factor X por un complejo de Factor IX activado (Factor IXa) y Factor VIII activado (Factor VIIIa).

El Factor VIII de coagulación es, por lo tanto, una proteína clave en la ruta intrínseca de la cascada de coagulación. La función del FVIII es servir como un cofactor para la enzima FIXa e incrementar la eficiencia catalítica de esta proteasa de cinco a seis ordenes de magnitud (van Dieijen y otros. 1981. The Journal of Biological Chemistry 256: 3433-3442). La importancia del FVIII se demuestra mediante el trastorno de sangramiento severo Hemofilia A, que se caracteriza por la ausencia de FVIII activo (Kazazian y otros. 1995. The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Disease. En: Scriver, Beadet, Sly y Valle, Ed. New York, McGraw-HiIII Inc. III: 3241-3267).

La Hemofilia A es un trastorno de la sangre ligado al sexo que se caracteriza por una deficiencia del Factor VIII. La enfermedad se presenta en aproximadamente 0,01% de la población masculina. La hemofilia A puede tratarse administrando plasma de sangre que contiene Factor VIII obtenido de donantes sanos. Sin embargo, este tratamiento tiene varias desventajas. El suministro del Factor VIII es limitado y muy caro; la concentración del Factor VIII en la sangre es sólo aproximadamente de 100 ng/ml y los rendimientos utilizando los métodos de fraccionamiento de plasma actuales son bajos. Debido a que la procedencia de Factor VIII es sangre de donantes mezclada, el recipiente corre un alto riesgo de adquirir varias enfermedades infecciosas, incluyendo aquellas causadas por los virus de la hepatitis No A, hepatitis no B, hepatitis B o SIDA que pueden estar presentes en la sangre del donante. Además, los beneficiarios pueden desarrollar anticuerpos contra el factor VIII exógeno, algunos de los cuales puede reducir grandemente su efectividad.

Tal como se ha descrito anteriormente, el Factor VIII (FVIII) de coagulación sirve a su función en la ruta de coagulación intrínseca como un cofactor para el Factor IX activado (FIXa) en la activación proteolítica del Factor X (para revisiones, ver Fay, P. J. (1999) Thromb. Haemostasis 82, 193-200; Lenting, P. J., van Mourik, J.A., y Mertens, K. (1998) Blood 92, 3983-3996). El Factor VIII es una glicoproteína de 300 kDa que comprende una estructura de dominio discreta (A1-a1-A2-a2-B-a3-A3-C1-C2) (Lenting, P. J., van Mourik, J. A. y Mertens, K. (1998) Blood 92, 3983-3996; Vehar, G. A., Keyt, B., Eaton, D., Rodriguez, H., O'Brien, D. P., Rotblat, F., Opperman, H., Keck, R., Wood, W. I., Harkins, R. N., Tuddenham, E. G. D., Lawn, R. M., y Capon, D. J. (1984) Nature 312, 337-342). Los dominios A y C comparten un 30-40% de homología con los dominios A y C de la proteína relacionada estructuralmente Factor V, mientras que el dominio B y las regiones ácidas cortas a1, a2 y a3 son únicas para el FVIII (Church, W. R., Jernigan, R. L., Toole, J., Hewick, R. M., Knopf, J., Knutson, G. J., Nesheim, M. E., Mann, K. G. y Fass, D. N. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 6934-6937).

En el plasma, el FVIII circula como un heterodímero unido a un ión metálico, que consiste en una cadena pesada de 90-220 kDa (A1-a1-A2-a2-B) y una cadena ligera de 80 kDa (a3-A3-C1-C2) (Rotblat, F., O'Brien, D. P., O'Brien, F. J., Goodall, A. H., y Tuddenham, E. G. D. (1985) Biochemestry 24, 4294-4300; Kaufman, R. J., Wasly, L. C., y Dorner, A. J. (1988) J. Biol. Chem. 263, 6352-6362). La proteína inactiva esta estrechamente asociada con su proteína portadora, el Factor von Willebrand (vWF) (Lollar, P., Hill-Eubanks, D. C. y Parker, C. G. (1988) J. Bio. Chem. 263, 10451-10455). La proteólisis limitada por el trombo o Factor Xa convierte el precursor de FVIII en su derivado activado (Lollar, P., Knutson, G. J. y Fass, D. N. (1985) Biochemestry 24, 8056-8064; Eaton, D., Rodriguez, H. y Vehar G.A. (1986) Biochemestry 25, 505-512). El dominio B y la región ácida está en el borde del dominio A3, a continuación, se eliminan de la molécula (Fay, P. J., Haidaris, P. J, y Smudzin, T. M. (1991) J. Biol. Chaem. 266, 8957-8962), que conlleva a la perdida de la alta afinidad de unión a vWF (Lollar, P. y otros (1988) arriba). La molécula de FVIII activado resultante (FVIIIa) consiste en un heterodímero que comprende el dominio A2-a2 que está asociado de formato no covalentemente con la fracción A1-a1/A3-C1-C2 unida al ión metálico (Fay, P. J. y otros (1991) arriba).

En la cadena pesada y la cadena ligera del FVIII, se han identificado varias regiones como sitios interactivos con FIXa (Fay P. J., Beattie, T., Huggings, C. F. y Regan, L. M. (1994) J. Biol. Chem. 269, 20522-20527; Bajaj, S. P., Schmidt, A. E., Mathur, A, Padmanabhan, K., Zhong, D., Mastri, M., y Fay, P. J. (2001) J. Biol. Chem. 276, 16302-16309; Lenting, P. J., van de Loo, J. W. H. P., Donath, M. J., S., H., van Mourik, J. A y Mertens, K (1996) J. Biol. Chem. 271, 1935-1940). Los residuos del dominio A2 Arg⁴⁸⁴-Phe⁵⁰⁹, Ser⁵⁵⁸-Gln⁵⁶⁵ y Arg⁶⁹⁸-Asp⁷¹² contribuyen a la unión de la cadena pesada a FIXa (Fay. P. J., (1994) arriba; Bajaj., (2001) arriba; Fay, P. J., y Scandella, D. (1999) J. Biol. Chem. 274, 29826-29830). En la cadena ligera, la región del dominio A3 Glu¹⁸¹¹-Lys¹⁸¹⁸ se ha identificado como un sitio interactivo con FIXa (Lenting. P. J., (1996) arriba). Además, las regiones Arg⁴⁸⁴-Phe⁵⁰⁹ y Lys¹⁸⁰⁴-Lys¹⁸¹⁸ también se han identificado como epítopes dianas para anticuerpos que pueden existir en pacientes con Hemofilia. Dichos anticuerpos inhiben la actividad del FVIII interfiriendo con el ensamblaje del complejo del FVIIIa y el FIX activado (Haeley, J. F., Lubin, L. M., Nakay. H., Saenko, E. L., Hoyer, L. W., Scandella, D., y Lollar, P. (1995) J. Biol. Chem. 270, 14505-14509; Fijnvandraat, K., Celie, P. H. N., Turenhout, E. A. M., van Mourik, J. A., ten Cate, J. W., Mertens, k., Peters, M., y Vooberg, J. (1998) Blood 91, 2347-2352; Zhong, D., Saenko, E. L., Shima, M., Flech, M., y Scandella, D. (1998) Blood 92, 136-142).

La vida media del Factor VIII puede prolongarse influyendo en el mecanismo de degradación del Factor VIII (eliminación), por ejemplo, mediante la reducción de la afinidad del Factor VIII por los receptores que juegan un papel en su eliminación, directamente o modificando el factor VIII en su sitio o sitios de unión para el receptor o los receptores de eliminación relevantes o, de manera indirecta, utilizando compuestos que influyen en la unión entre el Factor VIII y sus receptores. Debido a que los receptores celulares implicados en dicho proceso y los sitios moleculares implicados en la interacción Factor VIII-receptor no se conocían, la producción de dichos agentes ha sido problemática.

La vida media de los heterodímeros del Factor VIII no activado...

1. Uso de un anticuerpo de unión a Factor VIII para la preparación de una composición farmacéutica para disminuir la degradación de Factor VIII y/o prolongar la vida media de Factor VIII en un fluido biológico, en el que el anticuerpo de unión a Factor VIII comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID No: 17 y 19 de las cadenas pesada y ligera de KM41 o las secuencias de aminoácidos SEQ ID No: 21 y 23 de las cadenas pesada y ligera de KM33.

2. Uso, según la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo consiste en las secuencias de aminoácidos SEQ ID No: 26 (KM33) o según la SEQ ID No: 25 (KM41).

3. Uso, según la reivindicación 1 ó 2, en el que la composición farmacéutica se utiliza para la prevención o tratamiento de un trastorno de la coagulación de la sangre y/o pérdida temporal de los sistemas trombolíticos o fibrinolíticos.

4. Uso, según la reivindicación 3, en el que dicho trastorno de la coagulación de la sangre es hemofilia A o enfermedad de von Willebrand y en el que la pérdida temporal tiene lugar durante o después de un procedimiento quirúrgico.