PROCEDIMIENTO DE PRODUCCIÓN DE VITAMINAS.
Un microorganismo eucariótico adecuado para la producción de farnesol o geranilgeraniol que comprende (a) un ácido nucleico recombinante que codifica una HMG-CoA reductasa (HMGR) tal que aumenta la acción de la HMGR;
y (b) una modificación genética para aumentar el suministro de acetil CoA
Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E08003596.
Solicitante: DCV INC. DOING BUSINESS AS BIO-TECHNICAL RESOURSES.
Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.
Dirección: 1035 SOUTH SEVENTH STREET MANITOWOC, WI 54220 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.
Inventor/es: MILLIS,JAMES R, Saucy,Gabriel G, Maurina-Brunker,Julie, McMullin,Thomas W.
Fecha de Publicación: .
Fecha Solicitud PCT: 6 de Julio de 1999.
Clasificación PCT:
- C07C45/41 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07C COMPUESTOS ACICLICOS O CARBOCICLICOS (compuestos macromoleculares C08; producción de compuestos orgánicos por electrolisiso electroforesis C25B 3/00, C25B 7/00). › C07C 45/00 Preparación de compuestos que tienen grupos C=O unidos únicamente a átomos de carbono o hidrógeno; Preparación de los quelatos de estos compuestos. › por hidrogenólisis o por reducción de grupos carboxilo o de sus derivados funcionales.
- C07D303/04 C07 […] › C07D COMPUESTOS HETEROCICLICOS (Compuestos macromoleculares C08). › C07D 303/00 Compuestos que contienen ciclos de tres miembros que tienen un átomo de oxígeno como único heteroátomo del ciclo. › que contienen solamente átomos de hidrógeno y carbono en adición a los átomos de oxígeno del ciclo.
- C07D311/72 C07D […] › C07D 311/00 Compuestos heterocíclicos que contienen ciclos de seis miembros que contienen un átomo de oxígeno como único heteroátomo, condensados con otros ciclos. › Derivados del 3,4-dihidro que tienen en la posición 2 al menos un radical metilo y en la posición 6 un átomo de oxígeno, p. ej. tocoferoles.
- C12P1/02 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA. › C12P 1/00 Preparación de compuestos o de composiciones, no prevista en los grupos C12P 3/00 - C12P 39/00, utilizando microorganismos o enzimas; Procedimientos generales de preparación de compuestos o composiciones que utilizan microorganismos o enzimas. › utilizando hongos.
Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania, Letonia, Ex República Yugoslava de Macedonia, Albania.
PDF original: ES-2357069_T3.pdf
Fragmento de la descripción:
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a procedimientos de producción de vitaminas, particularmente de 5 vitaminas A y E y compuestos relacionados. En particular, la presente invención se refiere a sistemas biológicos para la producción de farnesol o geranilgeraniol.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La vitamina E (d-alfa-tocoferol, 1) es un complemento nutricional importante en seres humanos y animales. El compuesto 1 se obtiene comercialmente mediante aislamiento de una variedad de aceites vegetales, o
10 semisintéticamente mediante metilación de anillo del d-gamma-tocoferol 2 de origen natural relacionado. Es una fuente más importante de vitamina E la síntesis total, que proporciona d,l-alfa-tocoferol 3. Aunque es una mezcla de isómeros, 3 proporciona mucha de la actividad biológica de 1 y se usa ampliamente debido a su menor coste y mayor disponibilidad. Para una discusión general de la vitamina E, véase L. Machlin, ed., “Vitamin E: A Comprehensive Treatise”, Marcel Dekker, NY, 1980.
**(Ver fórmula)**
El d,l-alfa-tocoferol 3 se obtiene haciendo reaccionar trimetilhidroquinona 4 con fitol 5 o isofitol 6 en presencia de un catalizador ácido, a menudo un ácido de Lewis tal como cloruro de cinc. Esta tecnología se ha revisado por S. Kasparek en L. Machlin, ed., “Vitamin E: A Comprehensive Treatise”, capítulo 2, pág. 8-65, Marcel Dekker, NY, 1965. Las referencias 140-166 de este capítulo proporcionan las referencias primarias de
20 procedimientos detallados de preparación del compuesto 3.
**(Ver fórmula)**
El isofitol 6 o fitol 5 necesarios para la preparación de 3 se obtienen mediante una síntesis multietapa. Los materiales de partida incluyen típicamente acetona (véase Kasparek en Machlin, “Vitamin E: A Comprehensive Treatise”, pág. 44-45, Dekker, NY 1980, y referencias citadas en la misma) y trímero cíclico de isopreno (Pond y col., US 3.917.710 y 3.862.988 (1975)).
Además, se preparó en primer lugar gamma-tocoferol mediante síntesis total por Jacob, Steiger, Todd y Wilcox (J. Chem. Soc. 1939, 542). Estos investigadores produjeron la vitamina haciendo reaccionar el éster de monobenzoato de 2,3-dimetilhidroquinona con bromuro de fitilo en presencia de cloruro de cinc, seguido de la retirada del benzoato, dando un bajo rendimiento (22%) de gamma-tocoferol. Las síntesis publicadas de tocoferoles y tocotrienoles se han revisado por S. Kasparek en L. Machlin, “Vitamin E - A Comprehensive Treatise”, Dekker, NY, 1980; sin embargo, no se han registrado procedimientos adicionales de preparación de gamma-tocoferol.
A pesar de los diversos procedimientos conocidos para preparar o aislar miembros de la familia de la vitamina E de compuestos, continúa habiendo la necesidad de procedimientos de producción mejorados y más eficaces.
Se usan vitamina A (retinol) y la provitamina A β-caroteno en productos farmacéuticos, enriquecimiento alimenticio y complementos dietéticos. El acetato (acetato de retinilo), propionato (propionato de retinilo) y palmitato (palmitato de retinilo) de la vitamina A son los derivados de vitamina A más generalmente usados. Todos de vitamina A, ésteres de vitamina A y β-caroteno actualmente producidos comercialmente se producen mediante síntesis química total, excepto algo de vitamina A que se aísla a partir de fuentes alimenticias. Véase en general “Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology”, volumen 24, páginas 140-158 (3ª ed. 1984).
Continúa habiendo la necesidad de procedimientos mejorados y económicos de producción de vitamina A y ésteres de vitamina A.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La Fig. 1A ilustra una representación esquemática de la ruta biosintética de isoprenoides dependiente de mevalonato.
La Fig. 1B ilustra una representación esquemática de la ruta biosintética de isoprenoides independiente de mevalonato.
La Fig. 2 ilustra una realización de una vía para la síntesis química de vitamina E a partir de geranilgeraniol.
La Fig. 3 ilustra una realización de una vía para la síntesis química de vitamina E a partir de farnesol.
La Fig. 4 ilustra el crecimiento y la producción de farnesol de cepas derivadas de la cepa MBNA1-13.
La Fig. 5 ilustra el crecimiento de cepas naturales, erg9 y con ERG9 reparado.
La Fig. 6 ilustra la producción de farnesol en microorganismos con producción amplificada de HMG-CoA reductasa.
La Fig. 7 ilustra la producción de farnesol y GG en cepas que sobreexpresan GGPP sintasas.
La Fig. 8 ilustra el efecto de la producción amplificada de FPP sintasa sobre la producción de farnesol y GG.
La Fig. 9 ilustra la ruta de conversión metabólica de isoprenol y prenol en farnesol.
La Fig. 10 ilustra una vía de síntesis química para la producción de acetato de vitamina A a partir de farnesol.
La Fig. 11 ilustra una vía de síntesis química alternativa para la producción de acetato de vitamina A a partir de farnesol.
La Fig. 12 ilustra un procedimiento para preparar β-caroteno a partir de retinal usando una reacción de acoplamiento de carbonilo.
La Fig. 13 ilustra un procedimiento para preparar β-caroteno usando una reacción de alquilación.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
1.0 Introducción
La presente invención proporciona un microorganismo eucariótico adecuado para la producción de farnesol o geranilgeraniol que comprende
(a) un ácido nucleico recombinante que codifica una HMG-CoA reductasa (HMGR) tal que aumenta la acción de la HMGR; y
(b) una modificación genética para aumentar el suministro de acetil CoA.
El farnesol puede usarse como material de partida para sintetizar químicamente ésteres de αtocoferilo. Como alternativa, el farnesol puede convertirse químicamente en GG. El GG, producido biológicamente o mediante síntesis a partir de farnesol, puede usarse entonces como material de partida para preparar α-tocoferol y ésteres de α-tocoferilo. Se describen en la presente memoria diversos aspectos de los materiales biológicos e intermedios útiles en la producción de farnesol o GG mediante producción biológica. Se describen también en la presente memoria procedimientos de producción de α-tocoferol y ésteres de α-tocoferilo usando farnesol y/o GG producidos mediante cualquier medio como material de partida.
La presente divulgación describe también un procedimiento para producir vitamina A a partir de farnesol.
2.0 Producción biológica de farnesol y GG
Los isoprenoides son la mayor familia de productos naturales, con aproximadamente 22.000 estructuras diferentes conocidas. Todos los isoprenoides derivan del compuesto C5 pirofosfato de isopentilo (IPP). Por tanto, las cadenas principales carbonadas de todos los compuestos isoprenoides se crean mediante adiciones secuenciales de las unidades C5 a la cadena poliprenoide en crecimiento.
Aunque las etapas biosintéticas que conducen desde IPP a isoprenoides son universales, existen dos rutas diferentes que conducen a IPP. Los hongos (tales como levadura) y animales poseen la ruta dependiente de mevalonato bien conocida (exhibida en la Fig. 1A) que usa acetil CoA como precursor inicial. Las bacterias y plantas superiores, por otro lado, poseen una ruta independiente de mevalonato recién descubierta, también designada en la presenta memoria como la ruta sin mevalonato (exhibida en la Fig. 1B) que parte desde piruvato y 3-fosfato de gliceraldehído [Lois y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 2105-2110 (1998); Rohmer y col., J. Am. Chem. Soc. 118, 2564-2566 (1996); Arigoni, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 10600-10605 (1997); Lange y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 2100-2104 (1998)]. En plantas (incluyendo microalgas), hay evidencias de que existen ambas rutas dependiente e independiente de mevalonato, siendo la primera citosólica y la segunda plastídica [Arigoni, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 10600-10605 (1997); Lange y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 2100-2104 (1998)]. Se han establecido varias etapas de la ruta independiente de mevalonato. La primera etapa, catalizada por 5-fosfato de D-1-desoxixilulosa sintasa, forma 5-fosfato de D-1-desoxixilulosa a partir de piruvato y 3-fosfato de gliceraldehído.... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Un microorganismo eucariótico adecuado para la producción de farnesol o geranilgeraniol que comprende
(a) un ácido nucleico recombinante que codifica una HMG-CoA reductasa (HMGR) tal que aumenta la 5 acción de la HMGR; y
(b) una modificación genética para aumentar el suministro de acetil CoA.
2. El microorganismo de la reivindicación 1, en el que la HMGR es una HMGR truncada en que el dominio regulador se ha eliminado.
3. El microorganismo de la reivindicación 1 en el que aumenta el número de copias de HMGR.
10 4. El microorganismo de la reivindicación 1, que es un hongo.
5. El microorganismo de la reivindicación 4, en el que dicho hongo es una levadura.
6. El microorganismo de la reivindicación 1, en el que dicho microorganismo comprende adicionalmente una modificación para reducir la acción de la escualeno sintasa.
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