PREPARACIONES DEL RECEPTOR DE TIROTROPINA, SUS REGIONES DE UNIÓN, INTERACTUACIONES DE ANTICUERPOS Y HORMONAS CON DICHAS PREPARACIONES Y SUS USOS.

Una preparación del receptor de la hormona estimulante del tiroides (TSHR) mutado,

que incluye al menos una mutación puntual, caracterizada porque al menos el aminoácido Arg situado en una posición correspondiente al aminoácido 255 de un TSHR humano de longitud completa ha sido mutado a un residuo de aminoácido cargado negativamente en dicha preparación del TSHR mutado, con lo cual dicha preparación de TSHR mutado interactúa diferencialmente con los auto-anticuerpos estimulantes del TSHR de suero de pacientes, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR de suero de pacientes y la TSH, porque (i) el efecto estimulante de los auto-anticuerpos estimulantes del THSR de suero de pacientes que interactúan con la preparación de TSHR mutado se reduce o suprime, cuando se compara con el efecto estimulante de los auto-anticuerpos estimulantes del THSR de suero de pacientes que interactúan con una preparación del TSHR de referencia que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a la de dicha preparación del TSHR mutado con la excepción de que dicha mutación de Arg situada en una posición correspondiente al aminoácido 255 del TSHR humano de longitud completa no está presente en dicha preparación del TSHR de referencia; (ii) el efecto estimulante de la TSH cuando interactúa con la preparación de TSHR mutado no es afectado, cuando se compara con el efecto estimulante de la TSH que interactúa con dicha preparación del TSHR de referencia, y (iii) el efecto bloqueante de los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR de suero de pacientes que interactúan con la preparación del TSHR mutado no es afectado o es aumentado, cuando se compara con el efecto bloqueante de los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR de suero de pacientes que interactúan con dicha preparación del TSHR de referencia, con lo cual dicha preparación del TSHR mutado es eficaz en la detección diferencial y la identificación de los auto-anticuerpos estimulantes del THSR de suero de pacientes, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR de suero de pacientes y la TSH en una muestra de fluido corporal que se somete a detección.

La presente invención se refiere a preparaciones del receptor de la hormona estimulante del tiroides (también llamada tirotropina). [Dicho receptor se abrevia en lo sucesivo con las siglas TSHR por la expresión inglesa Thyroid Stimulating Hormone Receptor]. En particular la invención se refiere a preparaciones del TSHR mutado, a interacciones de anticuerpos y hormonas con dichas preparaciones, a sus usos, a métodos de proporcionar dichas preparaciones, a regiones epitópicas y a los sitios de unión así identificados por los anticuerpos del TSHR y sus complejos.

La tirotropina u hormona estimulante del tiroides (abreviadamente en inglés TSH) es una hormona de la hipófisis (también llamada glándula pituitaria) que desempeña un papel clave en regular la función del tiroides. Su liberación es estimulada por la hormona liberadora de tirotropina (abreviadamente TRH por sus iniciales en inglés) formada en el hipotálamo y controla la formación y liberación de las importantes hormones tiroideas tiroxina (T4) y triyodotironina (T3). Sobre la base de un mecanismo de retroalimentación, el contenido de hormonas tiroideas del suero controla la liberación de la TSH. La formación de T3 y T4 por las células del tiroides es estimulada por la TSH mediante un proceso en el cual la TSH liberada por la hipófisis se une al TSHR de la membrana celular del tiroides.

Los autores de la presente invención han descrito recientemente en la solicitud de patente WO 2004/050708A2 un anticuerpo monoclonal humano para el TSHR, que actúa como un potente estimulante del TSHR. El sitio de unión en el TSHR para este anticuerpo monoclonal (hMAb TSHR1) no está descrito en el documento WO 2004/050708A2, pero se ha creído probable que el sitio o cavidad de unión es conformacional e implica regiones discontinuas del receptor que se pliegan conjuntamente. La identificación del sitio de unión, o región epitópica, del TSHR o sus residuos o secuencias de aminoácidos de unión esenciales para un anticuerpo monoclonal o recombinante para el TSHR, tal como hMAb TSHR1, sería de crucial importancia en la comprensión de la estructura del TSHR y la interactuación de anticuerpos humanos con dicho sitio de unión, y como tal debe facilitar una determinación mejorada de las poblaciones de auto-anticuerpos y el manejo subsiguiente de la enfermedad tiroidea asociada con una respuesta autoinmune al TSHR.

En la técnica está bien documentado que se pueden formar diversos tipos de auto-anticuerpos contra el TSHR en el curso de la enfermedad asociada con autoinmunidad para el TSHR. Dependiendo del tipo de estos auto-anticuerpos, puede ocurrir la inhibición de la formación y liberación de T3 y T4 debido a la protección del TSHR frente a las moléculas de la TSH, o bien, por otro lado, estas hormonas tiroideas pueden ser liberadas de un modo no controlado debido a que los auto-anticuerpos anti-TSHR mimetizan las acciones de la TSH y estimulan la síntesis y liberación de las hormonas tiroideas.

La enfermedad tiroidea autoinmune (abreviadamente en lo sucesivo AITD por la expresión inglesa Autoimmune Thyroid Disease) es la enfermedad autoinmune más común que afecta a diferentes poblaciones en todo el mundo. Una proporción de pacientes con AITD, principalmente los que padecen la enfermedad de Graves, tienen autoanticuerpos para el TSHR sustancialmente como los descritos antes. Los auto-anticuerpos se unen al TSHR y usualmente mimetizan las acciones de la TSH, estimulando la glándula tiroides para producir altos niveles de hormonas tiroideas. De estos auto-anticuerpos se ha descrito que tienen actividad estimulante. Los auto-anticuerpos estimulantes también interactúan con los TSHR en los tejidos oculares y causan al menos algunos de los signos de la enfermedad de Graves. En algunos pacientes, los auto-anticuerpos se unen al TSHR pero no estimulan la producción hormonas tiroideas y se describen como poseedores de actividad bloqueante [J. Sanders, Y, Oda, S-A. Roberts, M. Maruyama, J. Furmaniak, B. Rees Smith "Understanding the thyrotropin receptor function-structure relationship" Bailliere's Clinical Endocrinology and Metabolism. Ed. T. F. Davies 1997 11(3): 451-479. Pub. Bailliére Tindall, London].

Las medidas de los auto-anticuerpos del TSHR son importantes en el diagnóstico y manejo de la AITD, particularmente la enfermedad de Graves. Se usan tres tipos usuales de ensayos para medir los auto-anticuerpos del TSHR.

(a) ensayos de unión competitivos que miden la capacidad de los auto-anticuerpos del TSHR para inhibir la unión de la TSH a preparaciones del TSHR;

(b) bioensayos que miden la capacidad de los auto-anticuerpos del THSR para estimular las células que expresan el TSHR en cultivo; y

(c) inmunoprecipitación de las preparaciones del TSHR con auto-anticuerpos del THSR.

Las medidas de los auto-anticuerpos para el THSR usando dichos ensayos están descritas en las referencias siguientes: J. Sanders, Y. Oda, S-A. Roberts, M. Maruyama, J. Furmaniak, B. Rees Smith "Understanding the thyrotropin receptor function-structure relationship"; Bailliere's Clinical Endocrinology and Metabolism. Ed; T F Davies 1997 11(3): 451-479. Pub. Bailliére Tindall, London; y J. Sanders, Y. Oda, S. Roberts, A. Kiddie, T. Richards, J. Bol-ton, V. McGrath, S. Walters, D. Jaskólski, J. Furmaniak, B. Rees Smith "The interaction of THSR auto-antibodies with 125I-labelled TSHR", Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 1999, 84(10):3797-3802.

Sin embargo existen cierto número de limitaciones asociadas con el uso de los ensayos actualmente disponibles antes descritos para medir los auto-anticuerpos del THSR. Los ensayos competitivos de tipo (a) que están disponibles en diferentes formatos son generalmente sensibles, fáciles de realizar y adaptables para un uso rutinario. Sin embargo, los ensayos con radio-receptores competitivos conocidos hasta la fecha para detectar auto-anticuerpos del THSR tienen unos inconvenientes importantes de naturaleza práctica (que pueden ser atribuidos al hecho de que la capacidad de unión de las preparaciones del TSHR generalmente reaccionan muy sensiblemente a cambios en el receptor o en una biomolécula unida por él) y además no permiten se lleven a cabo diagnósticos diferenciales de poblaciones de auto-anticuerpos (por ejemplo la diferenciación de auto-anticuerpos estimulantes o bloqueantes como se ha indicado antes).

En lo que respecta a los bioensayos del tipo mencionado en (b) estos tienden a ser costosos, consumen mucho tiempo en su realización y requieren un personal muy cualificado.

Con respecto a los ensayos de inmunoprecipitación directa del tipo (c), en la práctica hay frecuentemente episodios de sensibilidad asociados a los mismos y de nuevo no ha sido posible hasta la fecha diagnósticos diferenciales de poblaciones de auto-anticuerpos.

Como se apreciará del análisis anterior, sigue existiendo la necesidad en la técnica de proporcionar ensayos mejorados para la detección de auto-anticuerpos del TSHR, y por ejemplo sería ventajoso poder distinguir entre los autoanticuerpos estimulantes y los bloqueantes asociados con la autoinmunidad para el TSHR. Para este fin, el documento de patente WO 01/27634 describe un método de ensayo para llevar a cabo la determinación del diagnóstico diferencial de auto-anticuerpos del THSR, con lo cual en teoría pueden ser selectivamente determinados en una muestra los auto-anticuerpos estimulantes del THSR, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR y auto-anticuerpos del THSR no patógenos (ni estimulantes ni bloqueantes). Se emplea un TSHR-quimera en donde las secuencias del TSHR requeridas para la unión de los auto-anticuerpos estimulantes y/o los bloqueantes del THSR están reemplazadas por secuencias de un receptor diferente de la clase de receptores acoplados a la proteína G. También se describe en el documento el uso de TSHR recombinante de tipo natural solubilizado en la mezcla de reacción, cuando esto se requiera. Puede verse que la quimera A representa el TSHR-quimera en donde los aminoácidos 8-165 del TSHR están reemplazados por los aminoácidos 10-166 del receptor de la lutropina/coriogonadotropina; la quimera B representa el TSHR-quimera en donde los aminoácidos 261-370 del TSHR están reemplazados por los aminoácidos 261-329 del receptor de la lutropina/coriogonadotropina; y la quimera C representa el TSHR-quimera en donde los aminoácidos 8-165 y 261-370 del TSHR están remplazados por los aminoácidos 10-166 y 261-370 respectivamente del receptor de la lutropina/coriogonadotropina.

El documento de patente WO 01/63296 describe similarmente un método de ensayo para llevar a cabo... [Seguir leyendo]

1. Una preparación del receptor de la hormona estimulante del tiroides (TSHR) mutado, que incluye al menos una mutación puntual, caracterizada porque al menos el aminoácido Arg situado en una posición correspondiente al aminoácido 255 de un TSHR humano de longitud completa ha sido mutado a un residuo de aminoácido cargado negativamente en dicha preparación del TSHR mutado, con lo cual dicha preparación de TSHR mutado interactúa diferencialmente con los auto-anticuerpos estimulantes del TSHR de suero de pacientes, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR de suero de pacientes y la TSH, porque (i) el efecto estimulante de los auto-anticuerpos estimulantes del THSR de suero de pacientes que interactúan con la preparación de TSHR mutado se reduce o suprime, cuando se compara con el efecto estimulante de los auto-anticuerpos estimulantes del THSR de suero de pacientes que interactúan con una preparación del TSHR de referencia que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a la de dicha preparación del TSHR mutado con la excepción de que dicha mutación de Arg situada en una posición correspondiente al aminoácido 255 del TSHR humano de longitud completa no está presente en dicha preparación del TSHR de referencia; (ii) el efecto estimulante de la TSH cuando interactúa con la preparación de TSHR mutado no es afectado, cuando se compara con el efecto estimulante de la TSH que interactúa con dicha preparación del TSHR de referencia, y (iii) el efecto bloqueante de los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR de suero de pacientes que interactúan con la preparación del TSHR mutado no es afectado o es aumentado, cuando se compara con el efecto bloqueante de los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR de suero de pacientes que interactúan con dicha preparación del TSHR de referencia, con lo cual dicha preparación del TSHR mutado es eficaz en la detección diferencial y la identificación de los auto-anticuerpos estimulantes del THSR de suero de pacientes, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR de suero de pacientes y la TSH en una muestra de fluido corporal que se somete a detección.

2. Una preparación del TSHR mutado de acuerdo con la reivindicación 1, en donde al menos el aminoácido Arg situado en una posición correspondiente al aminoácido 255 del TSHR humano de longitud completa está mutado puntualmente a Asp.

3. A preparación de TSHR mutado de acuerdo con la reivindicación 1, que incluye al menos una mutación puntual, caracterizada porque al menos el aminoácido Arg situado en una posición correspondiente al aminoácido 255 de un TSHR humano de longitud completa ha sido mutado a Asp en dicha preparación de TSHR mutado, con lo cual dicha preparación de TSHR mutado interactúa diferencialmente con los auto-anticuerpos estimulantes del TSHR de suero de pacientes, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR de suero de pacientes y la TSH, porque (i) el efecto estimulante de los auto-anticuerpos estimulantes del THSR de suero de pacientes que interactúan con la preparación de TSHR mutado se reduce o suprime, cuando se compara con el efecto estimulante de los auto-anticuerpos estimulantes del THSR de suero de pacientes que interactúan con una preparación del TSHR de referencia que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a la de dicha preparación del TSHR mutado con la excepción de que dicha mutación de Arg situada en una posición correspondiente al aminoácido 255 del TSHR humano de longitud completa no está presente en dicha preparación del TSHR de referencia; (ii) el efecto estimulante de la TSH cuando interactúa con la preparación de TSHR mutado no es afectado, cuando se compara con el efecto estimulante de la TSH que interactúa con dicha preparación del TSHR de referencia, y (iii) el efecto bloqueante de los autoanticuerpos bloqueantes del THSR de suero de pacientes que interactúan con la preparación del TSHR mutado no es no afectado o es aumentado, cuando se compara con el efecto bloqueante de los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR de suero de pacientes que interactúan con dicha preparación del TSHR de referencia, con lo cual dicha preparación del TSHR mutado es eficaz en la detección diferencial y la identificación de los auto-anticuerpos estimulantes del THSR de suero de pacientes, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR de suero de pacientes y la TSH en una muestra de fluido corporal que se somete a detección.

4. Una preparación de TSHR mutado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que es un TSHR humano de longitud completa mutado.

5. Una preparación de TSHR mutado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que es un fragmento mutado de un TSHR humano.

6. Una preparación de TSHR mutado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que incluye más mutaciones de aminoácidos que representan sustituciones, adiciones o deleciones que no alteran la actividad del receptor de la TSH de la preparación de TSHR mutado.

7. Uso de una preparación de TSHR mutado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la detección diferencial e identificación de los auto-anticuerpos estimulantes del THSR, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR y la TSH, en una muestra de fluido corporal obtenida de un sujeto del que se sospecha que padece la enfermedad tiroidea autoinmune, es susceptible a ella, la tiene o se recupera de ella y/o en el diagnóstico de un sujeto del que se sospecha que padece la enfermedad tiroidea autoinmune, es susceptible a ella, la tiene o se recupera de ella.

8. Un kit que comprende una preparación de TSHR mutado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, junto con medios de detección que facilitan la monitorización de la interactuación diferencial de la preparación de TSHR mutado con los auto-anticuerpos estimulantes del THSR, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR y la

9. En combinación, un kit de acuerdo con la reivindicación 8, junto con una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un agente terapéutico eficaz en el tratamiento de la enfermedad tiroidea autoinmune.

10. Un método de detectar diferencialmente los auto-anticuerpos estimulantes para el THSR, los auto-anticuerpos bloqueantes para el THSR y la TSH en una muestra de fluido corporal obtenida de un sujeto del que se sospecha que padece la enfermedad tiroidea autoinmune, es susceptible a ella, la tiene o se recupera de ella, el cual método emplea una preparación de TSHR mutado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para interactuar diferencialmente y detectar los auto-anticuerpos estimulantes del THSR, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR y la TSH producidos en respuesta al TSHR contenido en dicha muestra del fluido corporal del sujeto.

11. Una composición farmacéutica que comprende una preparación de TSHR mutado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, junto con un vehículo, diluyente o excipiente para el mismo farmacéuticamente aceptable.

12. Una preparación de TSHR mutado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para uso en terapia.

13. Una preparación de TSHR mutado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para uso en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la enfermedad de Graves.

14. Una preparación de TSHR mutado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para uso en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de signos en los ojos de la enfermedad de Graves.

15. Un polinucleótido que comprende:

una secuencia de nucleótidos que codifica una preparación de TSHR mutado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

16. Secuencias de nucleótidos cebadores Arg 255 Asp F; Arg 255 Asp R identificadas en la Tabla 1; o una secuencia de nucleótidos que difiere de las mismas en secuencia de codones debido a la degeneración del código genético, en donde la secuencia del cebador mutante Arg 255 AspF es aggaactgatagcagacaacacctggactctta, y la secuencia del cebador mutante Arg 255 AspR es taagagtccaggtgttgtctgctatcagttcct.

17. Un sistema vector biológicamente funcional que lleva un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 15 y que es capaz de introducir el polinucleótido en el genoma de un organismo hospedante.

18. Una célula hospedante que está transformada o transfectada con un polinucleótido o uno o más polinucleótidos de acuerdo con la reivindicación 15 o un sistema vector de acuerdo con la reivindicación 17.

19. Un proceso de preparar una preparación de TSHR mutado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, comprendiendo dicho proceso:

(i) proporcionar una célula hospedante de acuerdo con la reivindicación 18;

(ii) dejar crecer la célula hospedante; y

(iii) recuperar del medio de crecimiento una preparación de TSHR mutado de acuerdo con la presente invención

20. Un proceso de identificar una preparación de TSHR mutado que se puede usar para la detección diferencial y la identificación de los auto-anticuerpos estimulantes del THSR y auto-anticuerpos bloqueantes del THSR y la TSH en una muestra de fluido corporal, comprendiendo dicho proceso identificar potenciales regiones de interactuación del TSHR y residuos de aminoácidos presentes en las mismas que se identifican además en virtud de su capacidad de interactuar con una pareja de unión para el TSHR, puesto que son los aminoácidos candidatos requeridos para la interactuación del TSHR con uno o más de los auto-anticuerpos estimulantes del THSR, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR y la TSH; producir mutaciones puntuales de dichos aminoácidos candidatos y monitorizar la interactuación de la preparación resultante del TSHR mutado con la pareja de unión, de modo que se identifiquen las mutaciones puntuales que dan como resultado la inhibición de la interactuación del TSHR mutado resultante con al menos uno de los auto-anticuerpos estimulantes del THSR, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR y la TSH, en donde se produce una mutación puntual para la Arg presente en una posición correspondiente al aminoácido número 255 de un TSHR humano de longitud completa, en donde la Arg 255 se somete a una mutación puntual selectivamente para obtener un residuo de aminoácido cargado negativamente tal que la preparación de TSHR mutado interactúa diferencialmente con los auto-anticuerpos estimulantes de los THSR, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR y la TSH.

21. Un proceso de identificar los residuos de aminoácidos requeridos para la interactuación del TSHR con uno o más de los auto-anticuerpos estimulantes del THSR, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR y la TSH, cuyo proceso comprende identificar potenciales regiones de interactuación del TSHR y residuos de aminoácidos presentes en las

mismas que además son identificadas en virtud de su capacidad de interactuar con una pareja de unión para el TSHR, puesto que son los aminoácidos candidatos requeridos para la interactuación del TSHR con uno o más de los auto-anticuerpos estimulantes del THSR, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR y la TSH; y producir mutaciones puntuales de dichos aminoácidos candidatos y monitorizar la interactuación de la preparación resultante del TSHR mutado con la pareja de unión, de modo que se identifique los aminoácidos claves requeridos para la interactuación respectiva del TSHR con uno o más de los auto-anticuerpos estimulantes del THSR, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR y la TSH, en donde se produce una mutación puntual para la Arg presente en una posición correspondiente al aminoácido número 255 de un TSHR humano de longitud completa, en donde el Arg 255 se somete a una mutación puntual selectivamente a un residuo de aminoácido cargado negativamente de tal modo que la preparación del TSHR mutado interactúe diferencialmente con los auto-anticuerpos estimulantes del THSR, los autoanticuerpos bloqueantes del THSR y la TSH.

22. Un proceso de identificar los residuos de aminoácidos requeridos para la conformación del TSHR de modo que se facilite su interactuación con uno o más de los auto-anticuerpos estimulantes del THSR, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR y la TSH, que comprende identificar potenciales regiones de interactuación del TSHR y los residuos de aminoácido presentes en las mismas que se identifican adicionalmente en virtud de su capacidad de interactuar con una pareja de unión para el TSHR, puesto que son los aminoácidos candidatos requeridos para la conformación de dicho TSHR de modo que se facilite su interactuación con dicho uno o más de los auto-anticuerpos estimulantes del THSR, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR y la TSH; producir mutaciones puntuales de dichos aminoácidos candidatos y monitorizar la interactuación de la preparación de TSHR mutado resultante con la pareja de unión, de modo que se identifiquen los aminoácidos claves requeridos para la conformación de dicho TSHR, de modo que se facilite la interactuación respectiva del TSHR con uno o más de los auto-anticuerpos estimulantes del THSR, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR y la TSH, en donde se produce una mutación puntual para la Arg presente en una posición correspondiente al aminoácido número 255 de un TSHR de longitud completa, en donde la Arg 255 se somete a mutación puntualmente a un residuo de aminoácido cargado negativamente de tal modo que la preparación del TSHR mutado interactúa diferencialmente con los auto-anticuerpos estimulantes del THSR, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR y la TSH.

23. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 20 a 22, en donde al menos la Arg presente en una posición correspondiente al aminoácido número 255 de un TSHR humano de longitud completa se somete a una mutación puntual selectivamente a un residuo de aminoácido cargado negativamente.

24. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 23, en donde dicho residuo de aminoácido cargado negativamente es Asp.

25. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 24, en donde la interactuación de la preparación del TSHR mutado que se monitoriza es la estimulación del TSHR mutado o el bloqueo de dicha estimulación.

26. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 25, que comprende monitorizar la producción de AMP cíclico como resultado de la interactuación de la pareja de unión con la preparación del TSHR mutado.

27.Uso en una preparación del TSHR mutado de un residuo de aminoácido que es diferente de la arginina en una posición correspondiente al aminoácido número 255 de un TSHR humano de longitud completa, en donde la Arg 255 está mutado puntual y selectivamente a un residuo de aminoácido cargado negativamente tal que la preparación del TSHR mutado interactúa diferencialmente con los auto-anticuerpos estimulantes del THSR, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR y la TSH, para la detección diferencial de uno o más de los auto-anticuerpos estimulantes del THSR de suero de pacientes, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR de suero de pacientes y la TSH, en una muestra de fluido corporal que se somete a detección.

28. Uso en una preparación del TSHR mutado de un residuo de aminoácido que es diferente de la arginina en una posición correspondiente al aminoácido número 255 de un TSHR humano de longitud completa, en donde la Arg 255 está mutado puntual y selectivamente a un residuo de aminoácido cargado negativamente tal que la preparación del TSHR mutado interactúa diferencialmente con los auto-anticuerpos estimulantes del THSR, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR y la TSH, en identificar los auto-anticuerpos estimulantes del THSR que está ausentes de, o presentes en, la muestra del fluido corporal.

29. Uso en una preparación del TSHR mutado de un residuo de aminoácido que es diferente de la arginina en una posición correspondiente al aminoácido número 255 de un TSHR humano de longitud completa, en donde la Arg 255 está mutado puntual y selectivamente a un residuo de aminoácido cargado negativamente tal que la preparación del TSHR mutado interactúa diferencialmente con los auto-anticuerpos estimulantes del THSR, los auto-anticuerpos bloqueantes del THSR y la TSH, en el diagnóstico de una enfermedad autoinmune asociada con el TSHR sometiendo a detección una muestra de fluido corporal.

30. Uso de acuerdo con la reivindicación 27, 28 o 29, en donde el residuo de aminoácido de la posición 255 de un TSHR humano de longitud completa es Asp.