Anticuerpos anti-TSHR humanos.

Una molécula de anticuerpo recombinante o monoclonal humana que se une al TSHR y que reduce la estimulación inducida por ligando del TSHR pero no tiene ningún efecto en la actividad constitutiva de TSHR en donde la molécula de anticuerpo humana aislada tiene la característica de autoanticuerpos de TSHR de suero del paciente de inhibir la unión de TSH y M22 al TSHR,

y en donde la molécula de anticuerpo humana aislada comprende SEC ID Nº: 70 (CDR I), SEC ID Nº: 71 (CDR II) y SEC ID Nº: 72 (CDR III) y SEC ID Nº: 42 o 52 (CDR I), SEC ID Nº: 43 o 53 (CDR II) y SEC ID Nº: 44 o 54 (CDR III).

Anticuerpos anti-TSHR humanos Campo de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales humanos (MAb) reactivos con el receptor de la hormona estimulante de la tiroides (TSH) (TSHR). Uno de los MAb humanos (K1-18) tiene la capacidad de unirse con el TSHR y de estimular la actividad de AMP cíclico de TSHR. El otro MAb humano (K1-7) tiene la capacidad de unirse con el TSHR y de bloquear la acumulación de AMP cíclico mediada por anticuerpos estimulantes de TSH y TSHR. Ambos MAb humanos se aislaron de los linfocitos periféricos de un paciente que presentaba síntomas clínicos de hipotiroidismo.

Antecedentes

La función tiroidea está regulada por TSH secretada por la hipófisis (Szkudlinski MW, ef al 22. Physiological Reviews 82: 473-52). La TSH se une con TSHR en la superficie de tirocitos y esto es la primera etapa en el inicio de la cascada de señalización de TSHR. La unión de TSH con el TSHR da lugar a la estimulación de la formación o liberación de hormonas tiroideas; tirosina (T4) y tri-yodotironina (T3). Un mecanismo de retroalimentación que implica los niveles de T4 y T3 en la circulación y hormona liberadora de tirotropina (TRH) secretada por el hipotálamo controla la liberación de TSH que a su vez controla la estimulación de la tiroides y los niveles de hormonas tiroideas en suero (Szkudlinski MW, et al, 22, mencionado anteriormente). El TSHR es un receptor acoplado a proteína G y está compuesto de tres dominios: un dominio de repetición rico en leucina (LRD), un dominio de escisión (CD) y un dominio transmembrana (TMD) (Núñez Miguel R, ef a/24. Thyroid 14: 991-111).

Está bien documentado en la técnica que algunos pacientes con enfermedad tiroidea autoinmunitaria (AITD) desarrollan autoanticuerpos que son reactivos con el TSHR (Rees Smith B, et al 1988. Endocrine Reviews 9: 16- 121). Hay dos tipos principales de autoanticuerpos de TSHR (TRAb); un tipo estimulante y un tipo de bloqueo. Los autoanticuerpos de tipo estimulante de la tiroides se unen con el TSHR e imitan las acciones de la TSH estimulando de este modo la tiroides para que produzca altos niveles de T4 y T3; estos autoanticuerpos también se describen como TRAb con actividad estimulante o actividad agonista de TSH (Rees Smith B, et al 27. Thyroid 17: 923-938). El mecanismo de control de retroalimentación de la función tiroidea ya no es eficaz en presencia de autoanticuerpos estimulantes de la tiroides y pacientes que presentan los síntomas clínicos de una tiroides hiperactiva caracterizado por un exceso de hormonas tiroideas en suero y sus consecuencias metabólicas. Esta afección se conoce como enfermedad de Graves. Los TRAb con actividad estimulante también pueden interaccionar con los TSHR en tejido - orbital y contribuir al desarrollo de las señales oculares de enfermedad de Graves. Se ha descrito en detalle en el documento WO 24/578A2 un autoanticuerpo monoclonal humano que actúa como un estimulador potente de la tiroides (hMAb TSHR1; también denominado M22). La estructura del complejo de M22 Fab unido con el TSHR LRD se ha resuelto por cristalografía de rayos X a una resolución de 2,55 A como se describe en el documento WO 28/25991A1. El análisis de la estructura del complejo de TSHR - M22 proporciona información detallada acerca de los restos del receptor y los restos del autoanticuerpo estimulante implicados en las interacciones entre sí.

Se ha usado M22 en ELISA para medición del anticuerpo de TSHR (Zóphel, K et al, Clínica Chimica Acta 29 y Zóphel, K et al, Clínica Chimica Acta 28).

Los TRAb de tipo de bloqueo aparecen menos frecuentemente en pacientes con AITD que los autoanticuerpos estimulantes. Los autoanticuerpos de tipo de bloqueo se unen con el TSHR, evitan que TSH se una con el receptor pero no tienen capacidad para estimular la actividad de TSHR. En consecuencia la formación y secreción de hormonas tiroideas (T4 y T3) se reduce en gran medida y los pacientes con este tipo de TRAb pueden presentar síntomas clínicos de un tiroides infraactivo (hipotiroidismo). Los autoanticuerpos de tipo bloqueo se conocen como TRAb con actividad de bloqueo o actividad antagonista de TSH (Rees Smith B, et al 1988 mencionado anteriormente y Rees Smith B, 27 et al mencionado anteriormente). Los TRAb con actividad de bloqueo cuando están presentes en suero de mujeres embarazadas cruzan la placenta y pueden bloquear los TSHR en la tiroides fetal conduciendo a hipotiroidismo neonatal y graves consecuencias para el desarrollo. Además, los TRAb con actividad de bloqueo pueden encontrarse en leche materna de madres afectadas y pueden provocar hipotiroidismo clínico en el bebé (Evans C, et al 24 European Journal of Endocrinology 15: 265-268). Un autoanticuerpos humano para el TSHR con actividad antagonista de TSHR (5C9) se ha descrito en detalle en el documento WO 28/99185A1. Los síntomas clínicos en pacientes con AITD y TRAb en circulación están relacionados con el efecto de autoanticuerpos en la actividad de TSHR, es decir si los TRAb provocan estimulación o bloqueo. Se ha propuesto, sin embargo, que en algunos pacientes puede estar presente simultáneamente una mezcla de TRAb de estimulación y bloqueo con la presentación clínica general relacionada con mayor concentración y/o actividad de un tipo de los TRAbs (Rees Smith B et al 1988 mencionado anteriormente; Furmaniak J ef a/ 1993 Springer Seminars in Immunopathology 14: 39-321 y Schott M et al 25 Trends in Endocrinology and Metabolism 16: 243-248). Además, las concentraciones y/o actividades de TRAb estimulantes o de bloqueo pueden variar en el mismo paciente durante la evolución de la enfermedad y de hecho se ha presentado fluctuación de síntomas de hipo a hipertiroidismo en el mismo paciente a lo largo del tiempo (Rees Smith B et a! 1988 mencionado anteriormente; Furmaniak J y Rees Smith B 1993

mencionado anteriormente y Schott M et al 25 mencionado anteriormente). Sin embargo, los intentos de separar los TRAb con diferente bioactividad o de diferenciar entre estos TRAb en muestras de suero usando bioensayos disponibles en la actualidad son difíciles. Más recientemente, la invención descrita en el documento WÓ26/16121A1 proporciona un medio para diferenciar entre tipos de TRAb estimulantes y de bloqueo usando bioensayos que emplean TSHR mutado en R255.

La TSH recombinante humana (Thyrogen®) es una preparación de TSH humana producida según las regulaciones de GMPc como una proteína recombinante y aprobada por la FDA de Estados Unidos como una ayuda para el diagnóstico de cáncer tiroideo residual o recurrente (Duntas LH, Cooper DS 28 Thyroid 18: 59-516). El control de los pacientes con cáncer tiroideo después del tratamiento incluye la estimulación de restos de tiroides o metástasis con TSH humana recombinante seguido de una exploración de tiroides y/o medida de los niveles de tiroglobulina en suero (Duntas LH y Cooper DS 28 mencionado anteriormente). La gonadotropina coriónica humana es una hormona producida durante el embarazo que tiene efectos leves estimulantes de la tiroides (Grossmann M et al 1997 Endocrlne Reviews 18: 476-51). La caracterización de los tipos de TRAb estimulantes o de bloqueo y cómo ¡nteracclonan con el TSHR tiene Importancia clínica para el desarrollo de métodos mejorados para diagnosticar y controlar diferentes formas de AITD. Además estos estudios son críticos para desarrollar nuevas estrategias para el control de enfermedades asociadas con una respuesta autoinmunitaria al TSHR. La disponibilidad de estimuladores de la tiroides potentes distintos de TSH humana recombinante proporcionan nuevas alternativas para controlar y tratar a pacientes con cáncer de tiroides.

Los anticuerpos aislados de linfocltos de sangre periférica de pacientes con enfermedad de Graves bloquean la unión de TSH a TSHR, según comunicó Valente et al (1982, Proceedings of the National Academy of Sciences of USA 79: es 668-6684 presenta los específicos del TSHR) mientras que los anticuerpos antagonistas y agonistas humanos se han comunicado por Kohn et al (1997, Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 82: 3998- 49).

Solicitudes de Patente previas relacionadas

La invención descrita en el documento W24/578A2 proporciona detalles de las propiedades de un autoanticuerpo monoclonal humano (MAb) con actividad estimulante potente y su interacción con el TSHR. Las interacciones entre este otro autoanticuerpo (M22) y el TSHR LRD se han resuelto a nivel molecular a partir de un análisis de difracción de rayos X (resolución de 2,55 A) de un complejo entre las dos moléculas como se describe en el documento W28/25991A1. El documento W26/16121A1 desvela una preparación del TSHR mutado que incluye al menos una mutación puntual que puede usarse en la exploración diferencial e identificación de autoanticuerpos... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de anticuerpo recombinante o monoclonal humana que se une al TSHR y que reduce la estimulación Inducida por ligando del TSHR pero no tiene ningún efecto en la actividad constitutiva de TSHR en donde la molécula de anticuerpo humana aislada tiene la característica de autoantlcuerpos de TSHR de suero del paciente de Inhibir la unión de TSH y M22 al TSHR, y en donde la molécula de anticuerpo humana aislada comprende SEC ID N°: 7 (CDR I), SEC ID N°: 71 (CDR II) y SEC ID N°: 72 (CDR III) y SEC ID N°: 42 o 52 (CDR I), SEC ID N°: 43 o 53 (CDR II) y SEC ID N°: 44 o 54 (CDR III).

2. Una molécula de anticuerpo humana aislada de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene al menos una característica adicional de autoanticuerpos de TSHR de suero del paciente seleccionada de una afinidad de unión por el TSHR de al menos 18 l/mol, preferentemente de al menos 19 l/mol, y la capacidad para bloquear la estimulación de TSHR inducida por ligando a una concentración de anticuerpo de menos de 1 pg/ml, preferentemente menos de ,1 pg/ml.

3. Una molécula de anticuerpo humana aislada de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2 que es un antagonista de TSH, autoanticuerpos estimulantes del tiroides o gonadotropina corlónlca humana.

4. Una molécula de anticuerpo aislada de acuerdo con cualquier reivindicación anterior que comprende un dominio VH de anticuerpo seleccionado de las secuencias de aminoácidos de SEC ID N° 41 y 51, preferentemente una molécula de anticuerpo aislada que comprende un dominio VH de anticuerpo que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID N°: 41 y 51.

5. Una molécula de anticuerpo humana aislada de acuerdo con cualquier reivindicación anterior que comprende una molécula de anticuerpo aislada que comprende un dominio VL de anticuerpo que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID N°: 69.

6. Un nucleótido aislado que codifica una molécula de anticuerpo aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

7. Un nucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 6 que comprende una secuencia de nucleótidos de SEC ID N°: 37, SEC ID N°: 46 o SEC ID N°: 64.

8. Un vector que incluye un nucleótido aislado de acuerdo con las reivindicaciones 6 o 7.

9. Una célula hospedadora que incluye un nucleótido de acuerdo con las reivindicaciones 6 o 7, o un vector de acuerdo con la reivindicación 8.

1. Una composición farmacéutica que comprende una molécula de anticuerpo aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

11. Una molécula de anticuerpo aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1 para uso en terapia.

12. Un método in vitro para caracterizar la actividad de anticuerpos de TSHR, TSH o gonadotropina coriónica humana, comprendiendo el método una etapa que incluye el uso de una molécula de anticuerpo aislada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

13. Un método de diagnóstico in vitro para detectar autoantlcuerpos de analitos para el TSHR, comprendiendo el método poner en contacto una muestra, que se ha aislado de un sujeto que se cree que contiene dichos autoanticuerpos de analitos, y una molécula de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 con un TSHR o un fragmento del mismo.

14. Un método de diagnóstico in vitro para detectar anticuerpos de analitos para el TSHR de acuerdo con la reivindicación 13 en el que el TSHR o el fragmento del mismo están mutado en la arginina 255 de modo que en dicho método de diagnóstico dicho TSHR mutado o dicho fragmento del mismo interaccionen preferentemente con anticuerpos de TSHR de tipo bloqueo de analito en comparación con anticuerpos de TSHR de tipo estimulante de analito.

15. Un método de diagnóstico in vitro de acuerdo con la reivindicación 14 en el que se detecta la unión de anticuerpo de TSHR de analito con TSHR26 o TSHR26 mutado en la arginina 255 mediante inhibición de la unión de un anticuerpo de TSHR marcado directa o directamente o de un fragmento del mismo con dicho TSHR26 o TSHR26 mutado en la arginina 255.

16. Un método de diagnóstico in vitro de acuerdo con la reivindicación 15 en el que dicho anticuerpo de TSHR marcado es un anticuerpo monoclonal, recombinante o sintético o un fragmento del mismo.