POLIPÉPTIDOS RECOMBINANTES BASADOS EN UNA ESTRUCTURA TRIPLE.

Polipéptidos recombinantes basados en una estructura triple SOLICITUD RELACIONADA Esta solicitud reivindica prioridad a la Solicitud de EE.UU. nº de serie 60/750.746, presentada el 15 de diciembre de 2005. FUNDAMENTO Los reactivos ligantes basados en proteínas tienen diversos usos en una aplicación terapéutica o diagnóstica. Se ha demostrado que los anticuerpos son un excelente paradigma de dichos reactivos. En realidad, se han usado exitosamente diversos anticuerpos monoclonales (mAbs; del inglés, monoclonal antibodies) para tratar cánceres, enfermedades infecciosas y enfermedades inflamatorias [Adams et al., Nat. Biotechnol., septiembre de 2005; 23 (9): 1147-57]. Se han potenciado tanto la eficacia como la seguridad de los mAbs murinos mediante la tecnología de DNA recombinante, incluyendo la quimerización y la humanización. Sin embargo, la humanización de mAbs murinos utilizando el injerto de regiones determinantes de complementariedad (CDR; del inglés, complementarity determining region) da a menudo lugar a una afinidad ligante menor que la de los equivalentes murinos. La afinidad del anticuerpo es un factor esencial en el éxito de un anticuerpo como agente terapéutico. Un anticuerpo con elevada afinidad permite que el anticuerpo compita eficazmente con el ligando natural por el receptor específico, para reducir la dosis, la toxicidad y el coste. La afinidad también afecta a la farmacocinética del anticuerpo, tal como su distribución y excreción dentro de un tejido específico y la circulación del huésped. Un requisito para un anticuerpo monoclonal eficaz in vivo es una elevada afinidad por el antígeno diana sin unión inespecífica a proteínas no relacionadas. Se ha mostrado que la multimerización de sitios ligantes de antígeno es un medio eficaz para aumentar la intensidad global de la unión de un anticuerpo a un antígeno, que se define como la avidez del anticuerpo (afinidad funcional) (Miller et al., j. Immunol. 170: 4854-4861, 2003; Rheinnecker et al., J. Immunol. 157: 2989-2997, 1996; Shopes, J. Immunol. 148: 2918-2922, 1992; Shuford et al., Science 252: 724-727, 1991; Wolff et al., J. Immunol. 148: 2469-2474, 1992). Tienen una actividad antitumoral in vivo aumentada (Liu et al., Int. Immunopharmacol. 6: 791-799, 2006; Wolff et al., Cancer Res. 53: 2560-2565, 1993). Debido a la naturaleza bivalente de la inmunoglobulina G (IgG), las IgGs convencional y genéticamente modificada no pueden ser utilizadas para la unión simultánea a más de dos antígenos diferentes. Por lo tanto, existe la necesidad de reactivos ligantes multivalentes o multiespecíficos basados en proteínas. En ciertos casos, para reducir los efectos secundarios de la mitogenicidad, es necesario evitar la función efectora, tal como la citotoxicidad mediada por células y dependiente de anticuerpos (ADCC; del inglés, antibody-dependent cellmediated cytotoxicity) y la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC; del inglés, complement dependent cytotoxicity), a través de la modificación genética de la región Fc. Por ejemplo, el mAb murino anti-CD3 humano (Orthoclone OKT3, Muromonab-CD3) es un potente agente inmunosupresor que se dirige al complejo del receptor de células T (TCR; del inglés, T-cell receptor)/CD3 presente sobre células T humanas. Se ha utilizado durante los dos últimos decenios para prevenir o tratar el rechazo de aloinjertos (Cosimi et al., N. Engl. J. Med. 305: 308-314, 1981; Group, N. Engl. J. Med. 313: 337-342, 1985; Kung et al., Science 206: 347-349, 1979). Sin embargo, un importante inconveniente del uso de esta terapia es la liberación sistémica de citocinas tales como TNF-, IL-2 e IFN-, lo que da lugar a una serie de efectos mitogénicos negativos, incluyendo síntomas griposos, insuficiencia respiratoria, síntomas neurológicos y necrosis tubular aguda (Abramowicz et al., Transplantation 47: 606-608, 1989; Chatenoud et al., N. Engl. J. Med. 320: 1420-1421, 1989, Goldman et al., Transplantation 50: 158-159, 1990; Toussaint et al., Transplantation 48: 524-526, 1989). Puesto que la actividad mitogénica de OKT3 y otros mAbs anti-CD3 depende de un intenso entrecruzamiento de TCR/CD3 a través de la unión a células positivas para FcR (por ejemplo, los monocitos), se han dedicado recientes esfuerzos a desarrollar formas no mitogénicas de anticuerpos anti-CD3 por alteración de la unión al FcR. Por lo tanto, existe la necesidad de reactivos ligantes basados en proteínas que presenten una elevada afinidad, un bajo efecto mitogénico y una elevada estabilidad in vivo. SUMARIO Este invento se refiere a reactivos ligantes basados en complejos proteicos, que presentan una elevada afinidad, un bajo efecto mitogénico y una elevada estabilidad in vivo. Los reactivos también pueden ser multivalentes o multiespecíficos. En consecuencia, un aspecto de este invento describe: ES 2 365 744 T3 un complejo proteico trímero que comprende tres polipéptidos, en que cada polipéptido consiste en: (a) un dominio andamio en bucle de triple hélice que consiste esencialmente en: 2 (i) una o más repeticiones de triple hélice, en que cada repetición es una secuencia de la fórmula siguiente: (X1-X2-X3)n, en que X1 es un resto de Gly, X2 y X3 son cualquier resto de aminoácido, y n es cinco o superior; (ii) la ID. SEC. nº 7; o (iii) la ID. SEC. nº 9; ES 2 365 744 T3 (b) un primer dominio heterólogo fusionado en marco con un extremo del dominio andamio, en que el primer dominio heterólogo es un dominio ligante seleccionado del grupo que consiste en un dominio de anticuerpo, un dominio ligante de ligandos, un ligando, un receptor y un proteoglicano, o que es una proteína fluorescente o un dominio enzimático; y (c) opcionalmente un segundo dominio heterólogo fusionado en marco con el otro extremo del dominio andamio, en que el segundo dominio heterólogo es un dominio ligante seleccionado del grupo que consiste en un dominio de anticuerpo, un dominio ligante de ligandos, un ligando, un receptor y un proteoglicano, o que es una proteína fluorescente o un dominio enzimático; en que los dominios andamio en bucle de triple hélice de los tres polipéptidos interaccionan entre sí para formar un complejo proteico trímero. Los dominios andamio primero, segundo y tercero están alineados para formar un bucle de triple hélice. El primer dominio heterólogo puede incluir la secuencia de un dominio enzimático o una proteína fluorescente. Los ejemplos de una proteína fluorescente incluyen GFP y dsRed, así como sus variantes. Los ejemplos de un dominio enzimático incluyen los de la glutatión S-transferasa, la luciferasa, la ß-galactosidasa y la ß-lactamasa. El primer dominio heterólogo puede incluir un dominio ligante (por ejemplo, un dominio ligante de ligandos, un ligando, un receptor o un proteoglicano) que se une a una pareja de unión. Una "pareja de unión" se refiere a cualquier molécula que presenta una afinidad covalente o no covalente específica por una porción de un deseado compuesto (por ejemplo, una proteína) de interés. Los ejemplos de parejas de unión incluyen miembros de pares de antígeno/anticuerpo, pares de proteína/inhibidor, pares de receptor/ligando (por ejemplo, pares de receptor nuclear o de superficie celular/ligando), pares de enzima/sustrato (por ejemplo, pares de cinasa/sustrato), pares de lectina/hidrato de carbono, pares proteicos oligómeros o heterooligómeros, pares de proteína ligante de DNA/sitio ligante de DNA, y pares de RNA/proteína. Los ejemplos del dominio ligante también incluyen las secuencias de etiquetas de afinidad, tales como una etiqueta de histidina, una etiqueta myc y una etiqueta de hemaglutinina. El primer dominio heterólogo anteriormente mencionado puede incluir una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR) de una inmunoglobulina. En consecuencia, el dominio heterólogo puede incluir partes de un anticuerpo que se unen a antígeno, tales como un dominio VH y un Fab. En una realización, el primer dominio heterólogo contiene la secuencia de un fragmento ligante de antígenos o de un anticuerpo de cadena única, por ejemplo, la específica del Grupo de Designación 3 (CD3; del inglés, Cluster of Designation 3) o del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR; del inglés, epidermal growth factor receptor). La primera cadena polipeptídica puede contener además un segundo dominio heterólogo fusionado en marco con el otro extremo del primer dominio andamio. Como el primer dominio heterólogo, el segundo dominio heterólogo puede incluir también un dominio que se une a una pareja de unión. Los dominios heterólogos primero y segundo pueden ser idénticos o diferentes entre sí. Se pueden unir a una pareja de unión idéntica o a dos parejas de unión diferentes. Por ejemplo, el primer dominio heterólogo y el segundo dominio heterólogo pueden contener, respectivamente, las secuencias de un primer anticuerpo de... [Seguir leyendo]

1. Un complejo proteico trímero que comprende tres polipéptidos, en que cada polipéptido consiste en: (a) un dominio andamio en bucle de triple hélice que consiste esencialmente en: (i) una o más repeticiones de triple hélice, en que cada repetición es una secuencia de la fórmula siguiente: (X1-X2-X3)n, en que X1 es un resto de Gly, X2 y X3 son cualquier resto de aminoácido, y n es cinco o superior; (ii) la ID. SEC. nº 7; o (iii) la ID. SEC. nº 9; (b) un primer dominio heterólogo fusionado en marco con un extremo del dominio andamio, en que el primer dominio heterólogo es un dominio ligante seleccionado del grupo que consiste en un dominio de anticuerpo, un dominio ligante de ligandos, un ligando, un receptor y un proteoglicano, o que es una proteína fluorescente o un dominio enzimático; y (c) opcionalmente un segundo dominio heterólogo fusionado en marco con el otro extremo del dominio andamio, en que el segundo dominio heterólogo es un dominio ligante seleccionado del grupo que consiste en un dominio de anticuerpo, un dominio ligante de ligandos, un ligando, un receptor y un proteoglicano, o que es una proteína fluorescente o un dominio enzimático; en que los dominios andamio en bucle de triple hélice de los tres polipéptidos interaccionan entre sí para formar un complejo proteico trímero. 2. El complejo proteico de la Reivindicación 1, en que X2 y X3 son cualquier resto de prolina o hidroxiprolina. 3. El complejo proteico de cualquiera de las Reivindicaciones 1 y 2, en que uno o más restos de prolina son sustituidos por hidroxiprolina. 4. El complejo proteico de cualquiera de las Reivindicaciones 1-3, en que el primer dominio heterólogo es un dominio de anticuerpo. 5. El complejo proteico de la Reivindicación 4, en que el dominio de anticuerpo está fusionado en marco con el extremo amínico del dominio andamio. 6. El complejo proteico de la Reivindicación 4, en que el dominio de anticuerpo está fusionado en marco con el extremo carboxílico del dominio andamio. 7. El complejo proteico de la Reivindicación 4, en que el dominio de anticuerpo comprende una o más regiones determinantes de complementariedad de una inmunoglobulina. 8. El complejo proteico de la Reivindicación 7, en que el dominio de anticuerpo comprende la secuencia de un fragmento ligante de antígeno. 9. El complejo proteico de la Reivindicación 8, en que el fragmento ligante de antígeno se une específicamente a CD3. 10. El complejo proteico de la Reivindicación 9, en que el fragmento ligante de antígeno comprende: (i) la ID. SEC. nº 3, o (ii) una secuencia codificada por un ácido nucleico que comprende la ID. SEC. nº 4. 11. El complejo proteico de la Reivindicación 8, en que el fragmento ligante de antígeno se une específicamente al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). 12. El complejo proteico de la Reivindicación 11, en que el fragmento ligante de antígeno comprende: (i) la ID. SEC. nº 1, o ES 2 365 744 T3 (ii) una secuencia codificada por un ácido nucleico que comprende la ID. SEC. nº 2. 13. El complejo proteico de la Reivindicación 11, en que el fragmento ligante de antígeno comprende: 18 (i) la ID. SEC. nº 5, o (ii) una secuencia codificada por un ácido nucleico que comprende la ID. SEC. nº 6. 14. El complejo proteico de la Reivindicación 9 u 11, en que el fragmento ligante de antígeno comprende un anticuerpo de cadena única. 15. El complejo proteico de la Reivindicación 4, en que cada polipéptido tiene un segundo dominio heterólogo que consiste en un segundo dominio de anticuerpo. 16. El complejo proteico de la Reivindicación 15, en que el primer dominio de anticuerpo comprende un primer anticuerpo de cadena única que se une específicamente a CD3. 17. El complejo proteico de la Reivindicación 16, en que el primer anticuerpo de cadena única comprende: (i) la ID. SEC. nº 3, o (ii) una secuencia codificada por un ácido nucleico que comprende la ID. SEC. nº 4. 18. El complejo proteico de cualquiera de las Reivindicaciones 15 a 17, en que el segundo dominio de anticuerpo comprende un segundo anticuerpo de cadena única que se une específicamente a EGFR. 19. El complejo proteico de la Reivindicación 18, en que el segundo anticuerpo de cadena única comprende: (i) la ID. SEC. nº 1, o (ii) una secuencia codificada por un ácido nucleico que comprende la ID. SEC. nº 2. 20. El complejo proteico de la Reivindicación 18, en que el segundo anticuerpo de cadena única comprende: (i) la ID. SEC. nº 5, o ES 2 365 744 T3 (ii) una secuencia codificada por un ácido nucleico que comprende la ID. SEC. nº 6. 21. El complejo proteico de la Reivindicación 1, en que el dominio andamio comprende 10 repeticiones G-P-P. 22. El complejo proteico de la Reivindicación 1, en que el dominio heterólogo de al menos uno de los polipéptidos es un dominio enzimático o una proteína fluorescente. 23. El complejo proteico de la Reivindicación 1, en que los tres polipéptidos son sustancialmente idénticos. 24. El complejo proteico de la Reivindicación 1, en que los tres polipéptidos contienen dominios heterólogos diferentes. 25. Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica un polipéptido de la Reivindicación 1. 26. Un vector de expresión que comprende un ácido nucleico de la Reivindicación 25. 27. Una célula huésped que comprende un ácido nucleico de la Reivindicación 25 o un vector de expresión de la Reivindicación 26. 28. La célula huésped de la Reivindicación 27, en que la célula es una célula de mamífero o una célula de insecto. 29. La célula huésped de la Reivindicación 28, en que la célula de mamífero es una célula de mieloma NS0 de ratón. 30. Una composición farmacéutica que comprende el complejo proteico de cualquiera de las Reivindicaciones 1-24. 31. Un método para producir un complejo proteico trímero de la Reivindicación 1, que comprende cultivar una célula huésped que contiene un primer ácido nucleico que codifica una primera cadena polipeptídica que contiene un primer dominio andamio de triple hélice y un primer dominio heterólogo fusionado con un extremo del primer dominio andamio, un segundo ácido nucleico que codifica una segunda cadena polipeptídica que contiene un segundo dominio andamio de triple hélice, y un tercer ácido nucleico que codifica una tercera cadena polipeptídica que contiene un tercer dominio andamio de triple hélice, en un medio bajo unas condiciones que permiten la expresión de los polipéptidos codificados por los tres ácidos nucleicos y la formación de un 19 bucle de triple hélice entre ellos; y ES 2 365 744 T3 purificar el complejo proteico a partir de la célula cultivada o del medio de la célula. 32. Un método de acuerdo con la Reivindicación 31, en que la célula huésped es una célula eucariótica que contiene una actividad enzimática que hidroxila un resto de prolina. ES 2 365 744 T3 FIGURA 1 21 ES 2 365 744 T3 FIGURA 2 22 ES 2 365 744 T3 FIGURA 3 23 ES 2 365 744 T3 FIGURAS 4A y 4B 24