POLIPÉPTIDOS AISLADOS BASADOS EN EL EPÍTOPO NEUTRALIZANTE DE LA PROTEÍNA P17 DEL VIH ÚTILES COMO VACUNAS, Y ANTICUERPOS ANTI-P17 NEUTRALIZANTES QUE RECONOCEN ESPECÍFICAMENTE DICHO EPÍTOPO NEUTRALIZANTE.
Polipéptido aislado que puede reaccionar específicamente con un anticuerpo neutralizante anti-p17 del VIH que consiste en la secuencia de aminoácidos NH2-X1-Gly-X2-X3-Leu-Asp-X4-Trp-Glu-X5-Ile-X6-Leu-Arg-COOH (SEQ ID NO:
1) en la que X1 es un residuo de aminoácido seleccionado entre Ser y Arg, X2 es un residuo de aminoácido seleccionado entre Gly, Glu y Ser; X3 es un residuo de aminoácido seleccionado entre Glu, Lys, Asp y Arg; X4 es un residuo de aminoácido seleccionado entre Arg, Ala, Lys, Thr, Ser, Glu, Asp y Gln; X5 es un aminoácido seleccionado entre Lys, Arg y Ser; y X6 es un residuo de aminoácido seleccionado entre Arg y Gln, siendo dicha secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 la secuencia del epítopo neutralizante de la proteína p17 del VIH entre las posiciones 9 y 22
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/IB2002/003093.
Solicitante: MEDESTEA RESEARCH & PRODUCTION S.P.A.
Nacionalidad solicitante: Italia.
Dirección: VIA CERNAIA 31 10121 TORINO ITALIA.
Inventor/es: FRANZONE, JOSE SEBASTIAN, CARUSO,ARNALDO.
Fecha de Publicación: .
Fecha Solicitud PCT: 5 de Agosto de 2002.
Fecha Concesión Europea: 18 de Agosto de 2010.
Clasificación PCT:
- A61K38/10 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE. › A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › A61K 38/00 Preparaciones medicinales que contienen péptidos (péptidos que contienen ciclos beta-lactama A61K 31/00; dipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina 2,5-dionas, A61K 31/00; péptidos basados en la ergolina A61K 31/48; que contienen compuestos macromoleculares que tienen unidades aminoácido repartidas estadísticamente A61K 31/74; preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos A61K 39/00; preparaciones medicinales caracterizadas por los ingredientes no activos, p. ej. péptidos como soportes de fármacos, A61K 47/00). › Péptidos que tienen de 12 a 20 aminoácidos.
- A61P31/18 A61 […] › A61P ACTIVIDAD TERAPEUTICA ESPECIFICA DE COMPUESTOS QUIMICOS O DE PREPARACIONES MEDICINALES. › A61P 31/00 Antiinfecciosos, es decir antibióticos, antisépticos, quimioterápicos. › para el VIH.
- C07K14/16 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › VIH-1.
- C07K7/08 C07K […] › C07K 7/00 Péptidos con 5 a 20 aminoácidos en una secuencia totalmente determinada; Sus derivados. › con 12 a 20 aminoácidos.
Clasificación antigua:
Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania, Letonia, Ex República Yugoslava de Macedonia, Albania.
Fragmento de la descripción:
Polipéptidos aislados basados en el epítopo neutralizante de la proteína p17 del VIH útiles como vacunas, y anticuerpos anti-p17 neutralizantes que reconocen específicamente dicho epítopo neutralizante.
La presente invención se refiere a polipéptidos aislados basados en una secuencia de la región amino terminal de la proteína p17 del VIH, útiles en el tratamiento y el diagnóstico del síndrome de inmunodeficiencia adquirida humana (SIDA), así como a los anticuerpos neutralizantes anti-p17 que reconocen específicamente esta secuencia amino terminal.
El SIDA comprende un grupo de síndromes clínicos provocados por un retrovirus denominado el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). El VIH infecta de una manera preferencial las células que expresan el antígeno CD4 en su superficie, por tanto los linfocitos T cooperadores y los macrófagos, pero también las células dendríticas de los ganglios linfáticos.
La infección por VIH puede bloquearse in vitro mediante anticuerpos obtenidos del suero de individuos infectados.
En el transcurso de los años se han desarrollado diversos anticuerpos neutralizantes del VIH, reaccionando la mayoría de ellos con los productos proteicos del gen env.
Estos productos proteicos se han utilizado como immunógenos de diversas formas, por ejemplo como extractos de glicoproteínas, proteínas recombinantes y péptidos sintéticos.
Los productos de env tradicionalmente se han considerado las proteínas más inmunogénicas del VIH y las más adecuadas para estimular una respuesta inmunitaria protectora frente al VIH.
Sin embargo, los investigadores también han centrado su atención en las proteínas codificadas por otros genes del VIH, por ejemplo las de gag. El gen gag, tal como se conoce, codifica para una poliproteína precursora que tiene un peso molecular de aproximadamente 55.000 (p55), que se corta con la proteasa de pol en los polipéptidos p24, p17 y p15 que constituyen las proteínas estructurales del núcleo del virión.
Algunos estudios han indicado que los productos del gen gag pueden ser la diana de una respuesta inmunitaria neutralizante.
En particular, se ha dado a conocer que la proteína p17 del VIH puede ser la diana de los anticuerpos que neutralizan la replicación del VIH y que altos niveles de anticuerpos anti-p17 se correlacionan con una evolución más lenta del SIDA.
La patente estadounidense 5.185.147 presenta varias secuencias de polipéptidos aisladas basadas en la región amino terminal de p17, que se describe que pueden inducir la aparición de anticuerpos anti-p17 que interaccionan con la partícula viral del VIH modificando la capacidad de infección in vitro. Sin embargo, tal como se conoce a partir de estudios con microscopio electrónico (por ejemplo Andreassen, H., H. Bohr, J. Bohr, S. Brunak, T. Bugge, R.M.J. Cotterill, C. Jacobsen, P. Kush, B. Lautrup, S.B. Petersen, T. Saemark y K. Ulrich, 1990, J. Acquir. Immune Def. Syndr. 3:615-622) la proteína p17 está ubicada dentro de la partícula viral y por tanto no está disponible para la interacción con anticuerpos anti-p17. La modificación de la capacidad de infección in vitro de la partícula viral del VIH ob-servada en este estudio, por tanto no es atribuible a una inhibición eficaz de la actividad biológica de la proteína p17.
El problema que trata la presente invención es el de encontrar polipéptidos basados en la secuencia de la proteína p17 que podrán inducir de manera eficaz la aparición de anticuerpos que neutralicen la actividad biológica de la proteína p17 del VIH.
Para resolver este problema, los presentes inventores en primer lugar han estudiado los mecanismos mediante los cuales la proteína p17 ejerce sus efectos biológicos.
Tal como se describirá en más detalle en la sección que se refiere a los ejemplos, se ha encontrado que la actividad biológica de p17 proviene por un lado de su capacidad para aumentar la producción de citocinas proinflamatorias que tienen acción pro-VIH, tales como IFN-γ y TNF-α, y por otro lado, de su capacidad para aumentar la producción de estas citocinas proinflamatorias cuando se inhibe mediante citocinas antiinflamatorias, tales como por ejemplo IL-4.
Además, los presentes inventores han encontrado que la actividad biológica de la proteína p17 se desarrolla a través de una interacción entre la proteína en forma de una entidad distinta, separada de la partícula viral, y los receptores específicos expresados en la superficie de la célula diana del VIH. Hasta el momento no se ha sugerido la existencia de estos receptores de p17 en los linfocitos que son la diana del VIH.
La presente invención se basa en el descubrimiento de la interacción p17/receptor.
Al estudiar la interacción p17/receptor, los inventores de hecho han identificado una región de la proteína p17 que constituye la región que se une al receptor celular y que puede provocar la aparición de anticuerpos inhiban la actividad biológica de la proteína p17, así como su unión al propio receptor. En la presente descripción, se indicarán estos anticuerpos como "anticuerpos neutralizantes anti-p17" y, cuando sea apropiado, se indicará esta región de unión como el "epítopo neutralizante".
Por tanto, los inventores han verificado que los polipéptidos aislados, que tienen una secuencia de aminoácidos basada en la del epítopo neutralizante de la proteína p17, es decir la secuencia en la región N-terminal que se encuentra entre las posiciones de aminoácidos 9 y 22 de p17, resuelven el problema que trata la presente invención dado que, debido a su estructura secundaria, tales polipéptidos pueden inducir la aparición de anticuerpos que neutralizan la actividad biológica de la proteína p17. Por tanto, tales polipéptidos son particularmente adecuados para su uso en una vacuna para interferir con la replicación del VIH.
La numeración de los residuos de aminoácidos de la secuencia de p17 utilizada en este caso es según la propuesta en Ratner et al. (1985), Nature 313:277.
Además, se ha demostrado que los polipéptidos de la invención se reconocen específicamente por anticuerpos monoclonales anti-p17 neutralizantes, mientras que no se reconocen por anticuerpos monoclonales anti-p17 no neutralizantes. Por tanto, tales polipéptidos son particularmente adecuados para su uso en métodos de diagnóstico para detectar la presencia de anticuerpos neutralizantes anti-p17 en un sujeto infectado con VIH, así como en métodos para la purificación de tales anticuerpos.
Por tanto, un primer objeto de la invención es un polipéptido aislado que puede reaccionar específicamente con un anticuerpo neutralizante anti-p17 del VIH, que tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde al epítopo neutralizante de la proteína p17 del VIH, es decir la secuencia que se encuentra entre la posición 9 y la posición 22 de la proteína p17 del VIH.
Tal como se describirá en más detalle en los ejemplos, los inventores han construido inicialmente un polipéptido sintético tal como se definió anteriormente, basado en la secuencia del epítopo neutralizante de la proteína p17 contenida en el plásmido BH10 (existencias de laboratorio). Este polipéptido sintético consiste en la secuencia NH2-Ser-Gly-Gly-Glu-Leu-Asp-Arg-Trp-Glu-Lys-Ile-Arg-Leu-Arg-COOH (SEQ ID NO: 2). Los inventores han verificado experimentalmente que este polipéptido se reconoce específicamente por anticuerpos monoclonales neutralizantes obtenidos frente a p17 de BH10.
Por tanto, este polipéptido es adecuado para su uso como un inmunógeno que puede provocar la aparición de anticuerpos que neutralicen la actividad biológica de p17 de BH10.
Además se ha verificado que variantes de la proteína p17 característica de otras cepas del VIH tienen cambios en la región del epítopo neutralizante que, sin embargo, no alteran significativamente su reconocimiento por anticuerpos que neutralizan la actividad biológica de la p17. Entre estas variantes se citan, a modo de ejemplo ilustrativo, las secuencias de la p17 de cepas virales frecuentes en África (clado C).
Los polipéptidos aislados que consisten en una secuencia de aminoácidos basada en la secuencia que se encuentra entre las posiciones 9 y 22 de la proteína p17 de las cepas virales frecuentes en zonas geográficas...
Reivindicaciones:
1. Polipéptido aislado que puede reaccionar específicamente con un anticuerpo neutralizante anti-p17 del VIH que consiste en la secuencia de aminoácidos NH2-X1-Gly-X2-X3-Leu-Asp-X4-Trp-Glu-X5-Ile-X6-Leu-Arg-COOH (SEQ ID NO: 1) en la que X1 es un residuo de aminoácido seleccionado entre Ser y Arg, X2 es un residuo de aminoácido seleccionado entre Gly, Glu y Ser; X3 es un residuo de aminoácido seleccionado entre Glu, Lys, Asp y Arg; X4 es un residuo de aminoácido seleccionado entre Arg, Ala, Lys, Thr, Ser, Glu, Asp y Gln; X5 es un aminoácido seleccionado entre Lys, Arg y Ser; y X6 es un residuo de aminoácido seleccionado entre Arg y Gln, siendo dicha secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 la secuencia del epítopo neutralizante de la proteína p17 del VIH entre las posiciones 9 y 22.
2. Polipéptido según la reivindicación 1, en el que dicha secuencia de aminoácidos es NH2-Ser-Gly-Gly-Glu-Leu-Asp-Arg-Trp-Glu-Lys-Ile-Arg-Leu-Arg-COOH (SEQ ID NO: 2).
3. Polipéptido según la reivindicación 1 ó 2, en el que una segunda secuencia de aminoácidos que puede aumentar la solubilidad del polipéptido se une directamente al residuo de aminoácido en la posición carboxilo terminal de dicha secuencia de aminoácidos del epítopo neutralizante de la proteína p17 del VIH.
4. Polipéptido según la reivindicación 3, en el que la segunda secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 3.
5. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que está conjugado con un portador.
6. Polipéptido según la reivindicación 5, que está conjugado con un portador mediante un residuo de cisteína (Cys) adicional o un dipéptido adicional -Nleu-Cys en la posición carboxilo terminal.
7. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que está en forma de un péptido ramificado.
8. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para su uso como una vacuna o un inóculo que puede generar una respuesta inmunitaria que neutraliza la actividad biológica de la proteína p17 del VIH.
9. Composición farmacéutica de vacuna o inóculo que comprende un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-7 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
10. Uso de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para la preparación de un medicamento que puede generar una respuesta inmunitaria que neutraliza la actividad biológica de la proteína p17 del VIH en un sujeto al que se administra.
11. Uso de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-7 como reactivo específico en una prueba para detectar la presencia de anticuerpos neutralizantes anti-p17 del VIH en una muestra de material biológico.
12. Uso de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-7 como un reactivo específico para la purificación de anticuerpos neutralizantes anti-p17 del VIH de una muestra de material biológico.
13. Anticuerpo monoclonal o policlonal dirigido frente a la proteína p17 del VIH, que puede neutralizar la actividad biológica de la proteína p17 del VIH y reconocer específicamente el epítopo neutralizante de la proteína p17 del VIH, siendo dicho epítopo neutralizante la secuencia de aminoácidos que se encuentra entre la posición 9 y la posición 22 de la proteína p17 del VIH y que consiste en -X1-Gly-X2-X3-Leu-Asp-X4-Trp-Glu-X5-Ile-X6-Leu-Arg- (SEQ ID NO: 1) en la que X1 es un residuo de aminoácido seleccionado entre Ser y Arg; X2 es un residuo de aminoácido seleccionado entre Gly, Glu y Ser; X3 es un residuo de aminoácido seleccionado entre Glu, Lys, Asp y Arg; X4 es un residuo de aminoácido seleccionado entre Arg, Ala, Lys, Thr, Ser, Glu, Asp y Gln; X5 es un residuo de aminoácido seleccionado entre Lys, Arg y Ser; y X6 es un residuo de aminoácido seleccionado entre Arg y Gln.
14. Anticuerpo según la reivindicación 13, en el que dicha secuencia de aminoácidos es la secuencia: -Ser-Gly-Gly-Glu-Leu-Asp-Arg-Trp-Glu-Lys-Ile-Arg-Leu-Arg- (SEQ ID NO: 2).
15. Anticuerpo según las reivindicaciones 13 ó 14, que es un fragmento de inmunoglobulina F(ab')2, Fab, Fab' o Fv.
16. Composición farmacéutica que comprende un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 13-15 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
17. Uso de un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 13-15 para la preparación de un medicamento terapéutico o profiláctico que puede inhibir la actividad inmunoestimulante de la proteína p17 del VIH producida en el transcurso de una infección por VIH.
18. Uso de un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 13-15 como un reactivo específico en una prueba para detectar la presencia de la proteína p17 del VIH en una muestra de material biológico.
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