PENTRAXINA LARGA PTX3 DESIALIDADA Y DESGLUCOSILADA.

Pentraxina PTX3 larga desglucosilada funcionalmente activa.

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La presente invención se refiere a pentraxina larga PTX3 totalmente desglucosilada funcionalmente activa.

En particular, la presente invención se refiere a pentraxina larga PTX3 totalmente desglucosilada funcionalmente activa y pentraxina larga PTX3 desialidada, procedimientos para su preparación, composiciones farmacéuticas que contienen estas sustancias y su uso para la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades en las que se indica el uso de pentraxina larga PTX3, particularmente enfermedades infecciosas, enfermedades inflamatorias, incluyendo enfermedades autoinmunes y enfermedades causadas por infarto tisular, enfermedades de hueso y cartílago, así como para el tratamiento de trastornos de fertilidad femenina y vacunas autólogas para el tratamiento de tumores.

Antecedentes de la invención

La pentraxina PTX3 larga se identifica por exploración diferencial de una bibliotecas de fagos de ADNc compuesta de células endoteliales humanas (HUVEC) sometida a tratamiento con IL1β (Breviario, y col., 1992, J. Biol. Chem.,

267: 22190-22197). Su secuencia de nucleótidos se desvela en la base de datos de NCBI con el número de acceso X63613. El ADNc de PTX3 codifica una proteína de 381 restos aminoacídicos caracterizada por un péptido señal para la secreción (restos 1-17), por un dominio N-terminal (restos 18-178) y por un dominio C-terminal (restos 179381). El gen de petraxina PTX3 larga humana se localiza en el cromosoma 3 en la región q25.2 y se caracteriza por 3 exones localizados en 6,72 kb de ADN genómico.

La PTX3 recombinante, purificada del sobrenadante de células CHO infectadas de forma estable con el vector plasmídico pSG5h-PTX3 que contiene el ADNc humano de PTX3, analizada por SDS-PAGE en condiciones reductoras, presenta un peso molecular aparente de 45 kDa (Bottazzi, y col., J. Biol. Chem., 1997; 272: 3281732823). Su secuencia de aminoácidos muestra un sitio de glucosilación potencial en el resto 220. El tratamiento de PTX3 con N-glucosidasa F conduce a la reducción de su peso molecular a aproximadamente 42 kDa (estimado por SDS-PAGE) de acuerdo con el valor calculado basándose en la secuencia de aminoácidos sola.

Este resultado confirma que PTX está N-glucosilada con una contribución de azúcar que constituye aproximadamente el 12 % del peso molecular. El análisis de la proteína analizada por SDS-PAGE en condiciones no reductoras produjo un peso molecular de aproximadamente 450 kDa (Bottazzi, y col., J. Biol. Chem., 1997; 272: 32817-32823). Estos resultados indican claramente que PTX3 se organiza principalmente en una estructura decamérica a través de la formación de puentes disulfuro intermoleculares entre los restos de cisteína de los monómeros individuales.

Sin embargo, el protocolo de desglucosilación propuesto en el artículo anteriormente mencionado no permite la preparación de una PTX3 funcionalmente activa, a la vista del hecho de que, para que esto se realice, son necesarias tanto desnaturalización como reducción de los puentes disulfuro de la proteína.

La proteína obtenida de acuerdo con el procedimiento de Bottazzi y col. no puede usarse como un medicamento, habiendo perdido sus características funcionales. No se sugiere, sin embargo, el uso de la pentraxina desglucosilada.

La presente invención resuelve el problema proporcionando pentraxina PTX3 desglucosilada funcionalmente activa.

Para una revisión de las pentraxinas, véase H. Gewurz, y col., Current Opinion in Immunology, 1995, 7:54-64.

Se conocen bien usos previos de PTX3.

La solicitud de patente internacional WO 99/32516, presentada en nombre del presente solicitante, desvela pentraxina PTX3 larga y su uso para la terapia de enfermedades infecciosas o inflamatorias o tumores.

El documento WO 02/38169 desvela el uso de pentraxina PTX3 larga para la preparación de un medicamento útil para el tratamiento de enfermedades asociadas con activación anómala del factor de crecimiento FGF-2.

El tratamiento de enfermedades autoinmunes mediante el uso de pentraxina PTX3 larga de desvela en el documento WO 02/36151.

El documento WO 03/011326 desvela el uso de pentraxina PTX3 larga para el tratamiento de infertilidad femenina.

El documento WO 03/084561 desvela el uso de pentraxina PTX3 larga para la preparación de un medicamento para el tratamiento de tumores asociados con activación anómala del factor de crecimiento FGF-8.

El documento WO 03/072603 desvela el uso de pentraxina PTX3 larga para la preparación de vacunas autólogas para el tratamiento de tumores.

PTX3 comparte con las pentraxinas cortas CRP y SAP la capacidad de unirse a C1q, un componente del sistema de complemento. La unión de PTX3 a C1q se satura con una Kd de 7,4 x 10-8 M. Estudios quinéticos de la interacción

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biomolecular entre PTX3 y C1q llevados a cabo usando el BIAcore ha hecho posible medir una Kon de 2,4 x 105 M-1 s 1 y una Koff de 4 x 104 s-1 (Bottazzi, y col., J. Biol. Chem., 1997; 272: 32817-32823).

El análisis comparativo de la homología de secuencia entre PTX3 y pentraxinas cortas ha revelado una homología sustancial del dominio C-terminal de PTX3 con la secuencia completa de CRP y SAP (Breviario, y col., 1992, J. Biol. Chem., 267: 22190-22197). Tanto CRP como SAP compiten por la unión de C1q a PTX3, lo que sugiere que las pentraxinas reconocen la misma región en C1q y que el dominio C-terminal de PTX3 es el sitio de unión de C1q. Estudios in vitro han mostrado que PTX3 activa la ruta de complemento clásica.

Pruebas experimentales y clínicas muestran que anomalías funcionales del complemento se asocian con una mayor propensión a infección por patógenos, demostrando de este modo una función esencial de este sistema inmune innato en la protección contra infecciones (Roos, y col., 2002, Immunobiol., 205: 595-609). En el campo médico, por lo tanto, existe una necesidad fuertemente percibida de fármacos capaces de estimular y amplificar la respuesta inmune para infecciones microbianas mediadas por complemento.

Además, los expertos en el campo están buscando fármacos que son crecientemente activos y capaces de actuar en sinergia con otros fármacos.

Descripción de la invención

Se ha descubierto ahora sorprendentemente que la retirada de ácido siálico del extremo de la cadena de glucósido o la retirada completa del grupo glucósido de PTX3 produce un aumento altamente significativo en la capacidad de esta proteína para activar la ruta de complemento clásica.

También se ha descubierto que PTX3 desprovisto de ácido siálico (desialidado) y PTX3 desglucosilado son agentes útiles para la prevención o tratamiento de enfermedades infecciosas, particularmente de infecciones fúngicas, bacterianas o virales a una dosis inferior que la usada con PTX3 no modificada. También se ha descubierto que PTX3 desprovista de ácido siálico (desialidada) y PTX3 desglucosilada son útiles en la prevención o tratamiento de enfermedades ya tratadas con PTX3 de origen natural, particularmente enfermedades inflamatorias, incluyendo enfermedades autoinmunes, tumores, enfermedades debidas a activación anómala del factor de crecimiento FGF-2, trastornos de la fertilidad femenina, enfermedades de hueso y cartílago y para la preparación de vacunas autólogas para el tratamiento de tumores.

También se ha descubierto que la PTX3 tanto desglucosilada funcionalmente activa como desialidada pueden usarse ventajosamente para la vacunación preventiva contra patógenos, mostrando una tendencia a favorecer una respuesta inmune de tipo adaptativo.

Un objeto de la presente invención es por lo tanto pentraxina PTX3 larga desglucosilada funcionalmente activa.

Otro objeto de la presente invención es la pentraxina PTX3 larga desialidada.

Otro objeto de la presente invención comprende procedimientos para la preparación de las proteínas anteriormente mencionadas.

Otro objeto de la presente invención comprende composiciones farmacéuticas que contienen pentraxina PTX3 desglucosilada funcionalmente activa o desialidada, como el principio activo y al menos un excipiente y/o vehículo farmacéuticamente aceptable.

Un objeto adicional de la presente invención es el uso de PTX3 larga desglucosilada funcionalmente activa o desialidada, o uno de sus análogos... [Seguir leyendo]

1. Pentraxina PTX3 larga desglucosilada funcionalmente activa.

2. Pentraxina PTX3 larga desialidada.

3. Pentraxina PTX3 larga de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que es de origen natural humano o no humano o recombinante.

4. Procedimiento de preparación de pentraxina PTX3 larga desglucosilada de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende la desglucosilación de pentraxina PTX3 larga.

5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dicha desglucosilación se lleva a cabo con endoglucosidasa EndoF3.

6. Procedimiento para la preparación de pentraxina PTX3 larga desglucosilada de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende el cultivo de células que expresan pentraxina PTX3 larga en presencia de un inhibidor de glucosilación.

7. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6 en el que dicho inhibidor es tunicamicina.

8. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dicha desglucosilación se obtiene por mutagénesis del sitio de glucosilación de PTX3.

9. Procedimiento para la preparación de pentraxina PTX3 larga desialidada de acuerdo con la reivindicación 2, que comprende la desialidación de pentraxina PTX3 larga.

10. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en el que dicha desialidación se lleva a cabo con Sialidasa A.

11. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4-8, en el que la pentraxina PTX3 larga desglucosilada es purificada.

12. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9-10, en el que la pentraxina PTX3 larga desialidada es purificada.

13. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11 o 12, en el que dicha purificación se realiza por cromatografía de filtración en gel.

14. Composición farmacéutica que contiene pentraxina PTX3 larga desglucosilada de acuerdo con la reivindicación 1 o 3 en una mezcla con al menos un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

15. Composición farmacéutica que contiene pentraxina PTX3 larga desialidada de acuerdo con la reivindicación 2 o 3 en una mezcla con al menos un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

16. Uso de pentraxina PTX3 larga desglucosilada de acuerdo con la reivindicación 1 o 3 o de pentraxina larga desialidada de acuerdo con la reivindicación 2 o 3 para la preparación de un medicamento.

17. Uso de pentraxina PTX3 larga desglucosilada de acuerdo con la reivindicación 1 o 3 o de pentraxina larga desialidada de acuerdo con la reivindicación 2 o 3 para la preparación de un medicamento capaz de unirse a complemento.

18. Uso de pentraxina PTX3 larga desglucosilada de acuerdo con la reivindicación 1 o 3 o de pentraxina larga desialidada de acuerdo con la reivindicación 2 o 3 para la preparación de un medicamento para la prevención o tratamiento de enfermedades en las que el uso de pentraxina PTX3 larga está indicado.

19. Uso de pentraxina PTX3 larga desglucosilada de acuerdo con la reivindicación 1 o 3 o de pentraxina larga desialidada de acuerdo con la reivindicación 2 o 3 para la preparación de un medicamento para la prevención o tratamiento de enfermedades infecciosas.

20. Uso de pentraxina PTX3 larga desglucosilada de acuerdo con la reivindicación 1 o 3 o de pentraxina larga desialidada de acuerdo con la reivindicación 2 o 3 para la preparación de un medicamento para la prevención o tratamiento de enfermedades inflamatorias, incluyendo enfermedades autoinmunes, tumores, enfermedades debidas a activación anómala del factor de crecimiento FGF-2, trastornos de fertilidad femenina, infarto tisular y enfermedades de hueso o cartílago.

21. Uso de acuerdo con la reivindicación 20, en el que dicha enfermedad autoinmune se selecciona del grupo que consiste en lupus eritematoso sistémico (SLE), esclerosis múltiple (MS), artritis, diabetes, tiroiditis, anemia hemolítica, orquitis atrófica, enfermedad de Goodpasture, retinopatía autoinmune, trombocitopenia autoinmune, miastenia grave, cirrosis biliar primaria, hepatitis crónica agresiva, colitis ulcerosa, dermatitis, glomerulonefritis crónica, síndrome de Sjögren, síndrome de Reiter, miositis, esclerosis sistémica y poliartritis.

22. Uso de acuerdo con la reivindicación 20, en el que dicho infarto tisular se selecciona del grupo que consiste en infarto cardíaco y cerebral.

23. Uso de acuerdo con la reivindicación 19, en el que en dichas enfermedades el agente infeccioso es una bacteria, hongo, protozoo o virus.

24. Uso de acuerdo con la reivindicación 23, en el que dicho hongo es un Aspergillus.

25. Uso de acuerdo con la reivindicación 24, en el que dicho hongo es Aspergillus fumigatus.

26. Combinación de pentraxina PTX3 larga desglucosilada funcionalmente activa y/o pentraxina PTX3 larga desialidada con un agente antifúngico.

27. Combinación de acuerdo con la reivindicación 26 en la que dicho agente antifúngico pertenece a la clase de anfotericina.

28. Combinación de acuerdo con la reivindicación 27 en la que dicha anfotericina es anfotericina B, particularmente como desoxicolato o en formulación liposomal.

29. Composición farmacéutica que contiene la combinación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 26-28 en una mezcla con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

30. Uso de la combinación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 26-28 para la preparación de un medicamento para la prevención o tratamiento de infecciones fúngicas.

31. Uso de acuerdo con la reivindicación 30, en el que el hongo en dicha infección es un Aspergillus.

32. Uso de acuerdo con la reivindicación 31, en el que dicho hongo es Aspergillus fumigatus.

33. Uso de pentraxina PTX3 larga desglucosilada de acuerdo con la reivindicación 1 o 3 o de pentraxina PTX3 larga desialidada de acuerdo con la reivindicación 2 o 3 como un adyuvante para la preparación de un medicamento para vacunación preventiva contra patógenos o antígenos.

34. Uso de acuerdo con la reivindicación 33, en el que dicho patógeno es una bacteria, hongo, protozoo o virus o dicho antígeno deriva de una bacteria, hongo, protozoo o virus.

35. Uso de acuerdo con la reivindicación 34, en el que dicho hongo es Aspergillus fumigatus o dicho antígeno deriva de Aspergillus fumigatus.

36. Vacuna caracterizada porque contiene pentraxina PTX3 larga desialidada y/o desglucosilada funcionalmente activa como un adyuvante.