Un conjunto heterogéneo de superficie multicolor de partículas poliméricas con subconjuntos de partículas que emiten una combinación única de luz fluorescente y que llevan un reactivo de captura particular;

teñidas con al menos dos colorantes fluorescentes; donde se pueden resolver al menos 16 subconjuntos de partículas basándose en la emisión variable de los al menos dos colorantes fluorescentes, donde la emisión de al menos un colorante procede de un colorante fluorescente unido covalentemente a la superficie de la partícula; todas las partículas en dicho conjunto heterogéneo de superficie multicolor de partículas poliméricas pueden unir una cantidad uniforme de un reactivo de captura; los colorantes fluorescentes se seleccionan del grupo constituido por excitables por luz UV/violeta, excitables a 488 nm, excitables a 532 nm (YAG), excitables a 595 nm (Krypton), excitables a 633 nm, excitables por luz infrarroja, conjugados en tándem de PE y APC excitables a 488 nm y a 633 nm, conjugados en tándem de colorantes reactivos (por ejemplo, colorantes Alexa) excitables a 488 nm y/o puntos cuánticos; y todas las partículas en dicho conjunto heterogéneo de superficie multicolor de partículas poliméricas están marcadas uniformemente con un reactivo de captura; con la condición de que los colorantes fluorescentes no sean nanopartículas coloreadas; donde dichas partículas primero se tiñen y a continuación se acoplan a un reactivo de captura en un momento posterior

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un conjunto heterogéneo de superficie multicolor de partículas poliméricas con subconjuntos de partículas que emiten una combinación única de luz fluorescente y que llevan un reactivo de captura particular; teñidas con al menos dos colorantes fluorescentes; donde se pueden resolver al menos 16 subconjuntos de partículas basándose en la emisión variable de los al menos dos colorantes fluorescentes, donde la emisión de al menos un colorante procede de un colorante fluorescente unido covalentemente a la superficie de la partícula; todas las partículas en dicho conjunto de partículas poliméricas pueden unir una cantidad uniforme de un reactivo de captura; los colorantes fluorescentes se seleccionan del grupo constituido por excitables por luz UV/violeta, excitables a 488 nm, excitables a 532 nm (YAG), excitables a 595 nm (Krypton), excitables a 633 nm, excitables por luz infrarroja, conjugados en tándem de PE y APC excitables a 488 nm y a 633 nm, conjugados en tándem de colorantes reactivos (por ejemplo, colorantes Alexa) excitables a 488 nm y/o puntos cuánticos; y todas las partículas en dicho conjunto heterogéneo de superficie multicolor de partículas poliméricas están marcadas uniformemente con un reactivo de captura; con la condición de que los colorantes fluorescentes no sean nanopartículas coloreadas; donde dichas partículas primero se tiñen y a continuación se acoplan a un reactivo de captura en un momento posterior. La invención también se refiere a un kit que comprende dicho conjunto heterogéneo de superficie multicolor de partículas poliméricas y los usos de dicho conjunto heterogéneo de superficie multicolor de partículas poliméricas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Se admite que para incrementar el número de permutaciones de combinaciones únicas de colorantes en una sola partícula se podrían usar dos o más colorantes en proporciones variables. Las longitudes de onda de emisión únicas y las intensidades de fluorescencia podrían ser útiles para análisis multiparamétricos o multiplex de una pluralidad de analitos en la misma muestra.

Se han descrito tres procedimientos de preparación de perlas fluorescentes coloreadas, incluyendo: (a) unión covalente de colorantes sobre la superficie de la partícula (por ejemplo, patente de EE.UU. Nº 4.774.189 de Schwartz, patente de EE.UU. Nº 5.194.300 de Cheung), (b) incorporación interna de colorantes durante la polimerización de las partículas (por ejemplo, patente de EE.UU. Nº 5.073.498 de Schwartz, patente de EE.UU. Nº 4.717.655 de Fulwyler), y

(c) coloración de la partícula después de que ya se haya polimerizado (por ejemplo, L.B. Bangs, Uniform Latex J Particles; Seragen Diagnostics Inc. 1984).

El documento de EE.UU. 5.194.300 de Cheung y de EE.UU. 4.774.189 de Schwartz describen microesferas fluorescentes que se recubren uniendo covalentemente uno o una pluralidad de colorantes fluorescentes a su superficie. No obstante, las características de las partículas no cumplen las especificaciones necesarias para el análisis multiplex: en el documento de EE.UU. 4.774.189 de Schwartz, se acoplan proteínas fluorescentes a partículas para generar patrones para el análisis por citometría de flujo usando proteínas fluorescentes similares. Se describe que se pueden generar partículas con intensidades de fluorescencia diferentes uniendo covalentemente proteínas fluorescentes a partículas. No obstante, puesto que estas partículas se diseñaron para su uso como patrones, no se ha tratado de acoplar simultáneamente dos fluorocromos a las partículas. Además, no se han llevado a cabo intentos para unir una molécula de reactivo de captura a las propias partículas. Las sondas fluorescentes usadas son proteínas que se desnaturalizan en condiciones rigurosas como las utilizadas para la hibridación de ADN en tampones usados en la inmunoprecipitación que contienen detergentes desnaturalizantes como el SDS. Además, la unión de proteínas fluorescentes a partículas comprenderá la unión de reactivos de captura, tales como anticuerpos, a las propias partículas. Por tanto, su procedimiento no es aplicable para generar partículas multicolores para análisis multiplex. El documento de EE.UU. 5.194.300 de Cheung informa de partículas fluorescentes pequeñas (300 Angstrom) que se podrían usar para aumentar las señales para su detección. Los inventores muestran que fue posible generar partículas que tienen una intensidad de fluorescencia única y un reactivo de captura unido a su superficie. No se informó de si la unión de los colorantes interfiere con la unión posterior de biomoléculas. Además, no se han hecho intentos de generar partículas con varias intensidades de fluorescencia diferentes o para acoplar dos colores a la misma partícula.

La segunda aproximación a la coloración de partículas está representada por la patente de EE.UU. Nº

5.073.498 de Schwartz y la patente de EE.UU. Nº 4.717.655 de Fulwyler. Esta última describe la adición de dos o más colorantes fluorescentes durante el proceso de polimerización y su dispersión aleatoria dentro del cuerpo de la partícula. No obstante, cuando estas partículas se exponen a una única longitud de onda de excitación, sólo se observa una señal fluorescente cada vez, y así, estas partículas no son útiles para análisis multiparamétricos, especialmente en un aparato de citometría de flujo con una sola fuente de luz de excitación. La patente de EE.UU. Nº 4.717.655 de Fulwyler describe dos colorantes mezclados en cinco relaciones diferentes y copolimerizados en una partícula. Aunque se reivindica que se obtienen cinco poblaciones de perlas, no se proporcionan las propiedades fluorescentes de estas perlas. En conclusión, tanto la patente de EE.UU. Nº 5.073.498 de Schwartz como la patente de EE.UU. Nº 4.717.655 de Fulwyler representan procedimientos complejos y costosos para la producción de partículas multicolor que comprenden la incorporación interna de colorantes.

El principio del tercer procedimiento, es decir, la incrustación o la difusión interna de un colorante después de que ya se haya polimerizado la partícula fue descrito originalmente por L. B. Bangs (Uniform Latex J Particles; Seragen Diagnostics Inc. 1984, p. 40) y consiste en la adición de un colorante hidrófobo o soluble en aceite a micropartículas agitadas y el aclarado del colorante después de la incubación. Las microesferas usadas en este procedimiento son de naturaleza hidrófoba. Esto permite la adopción del fenómeno de dilatación de estas partículas en un disolvente hidrófobo, que también puede contener colorantes fluorescentes hidrófobos. Una vez dilatadas, estas partículas absorberán los colorantes presentes en la mezcla disolvente de una manera que recuerda a la absorción del agua por parte de una esponja. El nivel y el grado de dilatación están controlados por el tiempo de incubación, la cantidad de agente de reticulación que evita la desintegración de la partícula, y la naturaleza y la cantidad del disolvente(s). Variando estos parámetros uno puede difundir un colorante a través de la partícula u obtener capas o zonas esféricas del tamaño y la forma deseados que contienen el colorante fluorescente. La retirada del disolvente finaliza el proceso de tinción. Las micropartículas teñidas de esta forma no "exudarán" el colorante en las disoluciones acuosas o en presencia de disolventes o tensioactivos con base acuosa como tensioactivos aniónicos, no iónicos, catiónicos, anfóteros, y bipolares. La patente de EE.UU. Nº 5.723.218 de Haugland describe la tinción de micropartículas por difusión con uno o más colorantes de difluoruro de dipirrometenoboro usando un procedimiento, que esencialmente es similar al método de Bangs. No obstante, cuando las perlas teñidas internamente con dos colorantes de dipirrometenoboro diferentes se excitan a longitudes de onda de 490 nm, presentan un solapamiento en el espectro de emisión. Por tanto, las perlas eran monocromáticas, y no multicolor. La patente de EE.UU. Nº 5.326.692 de Brinkley y col.; la patente de EE.UU. Nº

5.716.855 de Lerner y col., y patente de EE.UU. Nº 5.573.909 de Singer y col., describen la tinción fluorescente de micropartículas con dos o más colorantes fluorescentes. No obstante, los colorantes usados en estos procedimientos presentan un solapamiento en el espectro de excitación y emisión, que permite la transferencia de energía desde el primer colorante excitado al siguiente colorante y a lo largo de una serie de colorantes, que da como resultado la emisión de luz procedente del último colorante de la serie. Este... [Seguir leyendo]

1. Un conjunto heterogéneo de superficie multicolor de partículas poliméricas con subconjuntos de partículas que emiten una combinación única de luz fluorescente y que llevan un reactivo de captura particular; teñidas con al menos dos colorantes fluorescentes; donde se pueden resolver al menos 16 subconjuntos de partículas basándose en la emisión variable de los al menos dos colorantes fluorescentes, donde la emisión de al menos un colorante procede de un colorante fluorescente unido covalentemente a la superficie de la partícula; todas las partículas en dicho conjunto heterogéneo de superficie multicolor de partículas poliméricas pueden unir una cantidad uniforme de un reactivo de captura; los colorantes fluorescentes se seleccionan del grupo constituido por excitables por luz UV/violeta, excitables a 488 nm, excitables a 532 nm (YAG), excitables a 595 nm (Krypton), excitables a 633 nm, excitables por luz infrarroja, conjugados en tándem de PE y APC excitables a 488 nm y a 633 nm, conjugados en tándem de colorantes reactivos (por ejemplo, colorantes Alexa) excitables a 488 nm y/o puntos cuánticos; y todas las partículas en dicho conjunto heterogéneo de superficie multicolor de partículas poliméricas están marcadas uniformemente con un reactivo de captura; con la condición de que los colorantes fluorescentes no sean nanopartículas coloreadas; donde dichas partículas primero se tiñen y a continuación se acoplan a un reactivo de captura en un momento posterior.

2. El conjunto heterogéneo de superficie multicolor de partículas poliméricas de la reivindicación 1, en donde los colorantes se unen en concentraciones definidas.

3. El conjunto heterogéneo de superficie multicolor de partículas poliméricas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde dicho al menos un colorante fluorescente que está unido covalentemente a la superficie de la partícula está unido covalentemente a través de un agente de reticulación bifuncional o directamente a cada partícula.

4. El conjunto heterogéneo de superficie multicolor de partículas poliméricas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde todas las partículas en dicho conjunto heterogéneo de superficie multicolor de partículas poliméricas contienen suficientes sitios de unión para la unión covalente uniforme del reactivo de captura.

5. El conjunto heterogéneo de superficie multicolor de partículas poliméricas de la reivindicación 1, en donde el reactivo de captura está unido covalentemente a través de un agente de reticulación bifuncional o directamente a cada partícula.

6. El conjunto heterogéneo de superficie multicolor de partículas poliméricas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde dicho reactivo de captura es una proteína o un ácido nucleico.

7. El conjunto heterogéneo de superficie multicolor de partículas poliméricas según la reivindicación 6, en donde dicha proteína es una molécula basada en anticuerpos.

8. El conjunto heterogéneo de superficie multicolor de partículas poliméricas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde el tamaño de cada partícula es inferior a 100 µm de diámetro.

9. El conjunto heterogéneo de superficie multicolor de partículas poliméricas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde las partículas son partículas monodispersas.

10. El uso del conjunto heterogéneo de superficie multicolor de partículas poliméricas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 en análisis multiplex.

11. El uso del conjunto heterogéneo de superficie multicolor de partículas poliméricas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 en el campo del diagnóstico.

12. Un kit que comprende un conjunto heterogéneo de superficie multicolor de partículas poliméricas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9.