OLIGONUCLEÓTIDOS, UTILIZACIÓN, MÉTODO DE DETECCIÓN Y KIT QUE PERMITE DIAGNOSTICAR LA PRESENCIA DE LOS GENES H5 Y N1 DEL VIRUS DE LA GRIPE A.

Doble par de oligonucleótidos que permitirá la amplificación de dos secuencias diana localizadas respectivamente en el gen H5 y en el gen N1 del genoma del virus de la gripe A,

estando el par de oligonucleótidos para la amplificación del gen H5 constituido por: - un primer oligonucleótido de una longitud comprendida entre 10 y 50 nucleótidos y que comprende al menos un fragmento de 10 nucleótidos consecutivos obtenidos de: SEC ID Nº 1: TGTATGTTGTGGAATGGCA o su secuencia complementaria, y - un segundo oligonucleótido de una longitud comprendida entre 10 y 50 nucleótidos y que comprende al menos un fragmento de 10 nucleótidos consecutivos obtenidos de: SEC ID Nº 2: GCCGAATGATGCCATCAA, o su secuencia complementaria, mientras que el par de oligonucleótidos para la amplificación del gen N1 está constituido por: - un primer oligonucleótido de una longitud comprendida entre 10 y 50 nucleótidos y que comprende al menos un fragmento de 10 nucleótidos consecutivos obtenidos de: SEC ID Nº 3: CGTGGATTGTCTCCGAAA, o su secuencia complementaria, y - un segundo oligonucleótido de una longitud comprendida entre 10 y 50 nucleótidos y que comprende al menos un fragmento de 10 nucleótidos consecutivos obtenidos de: SEC ID Nº 4: GGAATGCTCCTGTTATCCTGA, o su secuencia complementaria

La presente invención se refiere a un procedimiento de marcado de ácidos nucleicos en presencia de al menos un soporte sólido. 5

La presente invención se refiere a oligonucleótidos que permitirán la amplificación y la detección de dos secuencias diana localizadas respectivamente en los genes H5 y N1 del genoma del virus de la gripe A.

La invención también se refiere a la utilización de estos oligonucleótidos, un método de detección y un kit que permite diagnosticar la presencia de los genes H5 y N1 del virus de la gripe A.

Entre las técnicas convencionales utilizadas de forma rutinaria para el diagnóstico de la gripe, pueden 10 mencionarse la aglutinación, la inhibición de aglutinación o la difusión en gel de agar. Estos métodos se emplean habitualmente y permite la caracterización del virus A de la gripe.

Una posible alternativa a estos métodos es el cultivo viral en huevos en fase de embrión o en células MDCK, de acuerdo con el protocolo del manual de la OIE (Oficina Internacional de las Epizootias). Sin embargo, se necesitan varios días para obtener los resultados de caracterización, plazo a veces incompatible con las necesidades o urgencias 15 clínicas.

También se han desarrollado masivamente técnicas de ELISA para la detección de anticuerpos o de antígenos o ensayos de inmunofluorescencia, pero estos métodos de detección, llamados inmunológicos, a menudo son menos sensibles y menos específicos que el cultivo viral convencional.

La reciente aparición de una forma altamente patógena del virus de la gripe aviar, el subtipo H5N1, ha 20 relazando, por lo tanto, fuertemente la necesidad de un ensayo de diagnóstico rápido, específico y muy sensible. Por esta razón, los diferentes métodos listados anteriormente han sido reemplazados progresivamente por técnicas llamadas moleculares, tales como la técnica de RT-PCR (transcripción inversa asociada a una reacción en cadena de la polimerasa). La RT-PCR, más sensible, no necesita la presencia de virus “viable” en las muestras, y de este modo ha permitido el tipado y sub-tipado de las diferentes formas del virus de la gripe. El desarrollo de esta técnica en tiempo real 25 (“real time RT-PCR”) también ha favorecido enormemente su utilización para el diagnóstico del virus de tipo A.

Por ejemplo, Whiley D. M. et al., describen en una reciente publicación (Diagnostic Microbiology and Infectious Diseases (2005), en prensa), un ensayo para la detección de un amplio espectro de subtipos de la gripe en muestras clínicas, basado en una reacción de RT-PCR que hace intervenir una 5' nucleasa. Dos oligonucleótidos y una sonda se seleccionaron para ser homólogos al gen que codifica la proteína M (matriz) de 23 subtipos del virus A. Este ensayo 30 permite, por lo tanto, la detección del virus de la gripe A en muestras clínicas pero no permite, por el contrario, el sub-tipado preciso de la forma implicada.

Ng E.K.O. et al., divulgaron recientemente (Emerging Infectious Diseases (2005) vol. 11 (8), p. 1303-1305) un ensayo basado en una reacción de RT-PCR múltiple que comprende dos etapas, utilizando dos juegos de oligonucleótidos y de sondas marcadas para fijar como objetivo específicamente dos regiones del gen HA de H5N1. 35 Esto ha permitido, de este modo, desarrollar un ensayo rápido y sensible para detectar directamente el subtipo H5 en muestras humanas. Este ensayo se validó en muestras clínicas procedentes de pacientes infectados en Hong Kong y en Vietnam por el subtipo H5N1 del virus, pero no permite diagnosticar directamente qué subtipo de virus está implicado en la infección.

Payungporn S. et al., describen (Viral Immunology (2004) vol. 17 (4), p. 588-593 y Journal of Virological 40 Methods (2005), en prensa) un método de detección simultánea de las secuencias M, H5 y N1 del subtipo H5N1, basado en un ensayo de RT-PCR múltiple en tiempo real y en una sola etapa. Oligonucleótidos correspondientes a las secuencias M, H5 y N1, así como diferentes sondas TaqMan marcadas se seleccionaron y utilizaron en el ensayo, para detectar simultáneamente tres señales fluorescentes. Los oligonucleótidos H5 y N1 se seleccionaron a partir de regiones invariables que abarcan más de 50 secuencias conocidas específicas del virus H5N1. Sin embargo, debe 45 observarse que este método de RT-PCR, no isotérmico, está sometido a contaminaciones.

Otro método molecular que puede emplearse para detectar la presencia de agentes infecciosos es la técnica NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification [Amplificación Basada en la Secuencia de Ácido Nucleico]). Por ejemplo, Collins R.A et al., describen (Journal of Virological Methods (2002) vol. 103, p. 213-225 y Avian Diseases (2003) vol. 47 (3), p. 1069-1074) la detección del subtipo H5 de la gripe aviar (detección del subtipo altamente patógeno 50 y débilmente patógeno) utilizando la técnica NASBA acoplada a un sistema de detección ECL (electroquimioluminiscencia). La técnica NASBA es un método de amplificación isotérmica de ácidos nucleicos que hace intervenir a varias actividades enzimáticas, que permite una detección rápida del virus H5. La amplificación de ácidos nucleicos por esta vía es muy adecuada para los genomas en ARN, como el genoma del virus de la gripe, gracias a la introducción de la etapa transcripción inversa directamente en la reacción de amplificación. Sin embargo, incluso 55 aunque el método descrito en esta publicación permite detectar y distinguir las cepas débilmente patógenas de las cepas altamente patógenas, no permiten identificar específicamente la forma H5N1 del virus. El documento WO 2005/121367 (publicado el 22-12-2005 que tiene una fecha de depósito del 10-06-2005) describe la secuencia de ácido nucleico cattggagtttgacacttggtgtt como cebador de amplificación para la detección del virus H5N1.

Un ensayo de identificación del virus de la gripe A en su forma H5N1 utilizando una técnica de amplificación 60 transcripcional, particularmente adaptada a la amplificación y a la detección de virus de ARN, sigue siendo, por lo tanto, esperado. Además un ensayo múltiple, es decir que permite la amplificación y la detección simultáneamente de los dos genes H5 y N1, siendo la técnica de amplificación una técnica de amplificación transcripcional tal como NASBA, es particularmente ventajoso.

La presente invención se refiere, por lo tanto, a un doble par de oligonucleótidos que permitirá la amplificación de dos secuencias diana localizadas respectivamente en el gen H5 y en el gen N1 del genoma del virus de la gripe A, estando el par de oligonucleótidos para la amplificación del gen H5 constituido por:

- un primer oligonucleótido de una longitud comprendida entre 10 y 50 nucleótidos y que comprende al menos un fragmento de 10 nucleótidos consecutivos obtenidos de: 5

SEC ID Nº 1: TGTATGTTGTGGAATGGCA, o su secuencia complementaria, y

- un segundo oligonucleótido de una longitud comprendida entre 10 y 50 nucleótidos y que comprende al menos un fragmento de 10 nucleótidos consecutivos obtenidos de:

SEC ID Nº 2: GCCGAATGATGCCATCAA, o su secuencia complementaria, mientras que el par de oligonucleótidos para la amplificación del gen N1 está constituido por: 10

- un primer oligonucleótido de una longitud comprendida entre 10 y 50 nucleótidos y que comprende al menos un fragmento de 10 nucleótidos consecutivos obtenidos de:

SEC ID Nº 3: CGTGGATTGTCTCCGAAA, o su secuencia complementaria, y

- un segundo oligonucleótido de una longitud comprendida entre 10 y 50 nucleótidos y que comprende al menos un fragmento de 10 nucleótidos consecutivos obtenidos de: 15

SEC ID Nº 4: GGAATGCTCCTGTTATCCTGA, o su secuencia complementaria.

La invención también puede referirse a un par de oligonucleótidos para permitir la amplificación de una secuencia diana localizada en el gen H5 del genoma del virus de la gripe A, estando el par de oligonucleótidos constituido por:

- un primer oligonucleótido de una longitud comprendida entre 10 y 50 nucleótidos y que comprende al menos un 20 fragmento de 10 nucleótidos consecutivos obtenidos de:

SEC ID Nº 1: TGTATGTTGTGGAATGGCA, o su secuencia complementaria, y

- un segundo oligonucleótido de una longitud comprendida entre 10 y 50 nucleótidos y que comprende al menos un fragmento de 10 nucleótidos consecutivos...

1. Doble par de oligonucleótidos que permitirá la amplificación de dos secuencias diana localizadas respectivamente en el gen H5 y en el gen N1 del genoma del virus de la gripe A, estando el par de oligonucleótidos para la amplificación del gen H5 constituido por:

- un primer oligonucleótido de una longitud comprendida entre 10 y 50 nucleótidos y que comprende al menos un fragmento de 10 nucleótidos consecutivos obtenidos de: 5

SEC ID Nº 1: TGTATGTTGTGGAATGGCA o su secuencia complementaria, y

- un segundo oligonucleótido de una longitud comprendida entre 10 y 50 nucleótidos y que comprende al menos un fragmento de 10 nucleótidos consecutivos obtenidos de:

SEC ID Nº 2: GCCGAATGATGCCATCAA, o su secuencia complementaria,

mientras que el par de oligonucleótidos para la amplificación del gen N1 está constituido por: 10

- un primer oligonucleótido de una longitud comprendida entre 10 y 50 nucleótidos y que comprende al menos un fragmento de 10 nucleótidos consecutivos obtenidos de:

SEC ID Nº 3: CGTGGATTGTCTCCGAAA, o su secuencia complementaria, y

- un segundo oligonucleótido de una longitud comprendida entre 10 y 50 nucleótidos y que comprende al menos un fragmento de 10 nucleótidos consecutivos obtenidos de: 15

SEC ID Nº 4: GGAATGCTCCTGTTATCCTGA, o su secuencia complementaria.

2. Par de oligonucleótidos que permitirá la amplificación de una secuencia diana localizada en el gen H5 del genoma del virus de la gripe A, estando el par de oligonucleótidos constituido por:

- un primer oligonucleótido de una longitud comprendida entre 10 y 50 nucleótidos y que comprende al menos un fragmento de 10 nucleótidos consecutivos obtenidos de: 20

SEC ID Nº 1: TGTATGTTGTGGAATGGCA o su secuencia complementaria, y

- un segundo oligonucleótido de una longitud comprendida entre 10 y 50 nucleótidos y que comprende al menos un fragmento de 10 nucleótidos consecutivos obtenidos de:

SEC ID Nº 2: GCCGAATGATGCCATCAA, o su secuencia complementaria.

3. Par de oligonucleótidos que permitirá la amplificación de una secuencia diana localizada en el gen N1 del 25 genoma del virus de la gripe A, estando el par de oligonucleótidos constituido por:

- un primer oligonucleótido de una longitud comprendida entre 10 y 50 nucleótidos y que comprende al menos un fragmento de 10 nucleótidos consecutivos obtenidos de:

SEC ID Nº 3: CGTGGATTGTCTCCGAAA, o su secuencia complementaria, y

- un segundo oligonucleótido de una longitud comprendida entre 10 y 50 nucleótidos y que comprende al menos 30 un fragmento de 10 nucleótidos consecutivos obtenidos de:

SEC ID Nº 4: GGAATGCTCCTGTTATCCTGA, o su secuencia complementaria.

4. Par(es) de oligonucleótidos, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado(s) porque el primer oligonucleótido comprende adicionalmente una secuencia promotora que puede ser reconocida por una enzima ARN polimerasa dependiente de ADN. 35

5. Par(es) de oligonucleótidos, de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado(s) porque la secuencia promotora que puede ser reconocida por una enzima ARN polimerasa dependiente de ADN es una polimerasa T7.

6. Par de oligonucleótidos, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 ó 5, en el que el primer oligonucleótido, cuando este oligonucleótido permite la amplificación de la secuencia diana localizada en el gen H5, se caracteriza porque está constituido esencialmente por la siguiente secuencia: 40

SEC ID Nº 5: AATTCTAATACGACTCACTATAGGGGTGTATGTTGTGGAATGGCA o su secuencia complementaria.

7. Par de oligonucleótidos, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en el que el primer oligonucleótido, cuando este oligonucleótido permite la amplificación de la secuencia diana localizada en el gen N1, se caracteriza porque está constituido esencialmente por la siguiente secuencia: 45

SEC ID Nº 6: AATTCTAATACGACTCACTATAGGGGCGTGGATTGTCTCCGAAA, o su secuencia complementaria.

8. Par de oligonucleótidos, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque cada oligonucleótido tiene una longitud comprendida entre 12 y 30 nucleótidos y que comprende al menos un fragmento de 16 nucleótidos consecutivos, y preferentemente una longitud comprendida entre 15 y 26 nucleótidos y que comprende al menos un fragmento de 18 nucleótidos. 50

9. Par de oligonucleótidos que se utilizará como sonda de detección de dos secuencias diana localizadas respectivamente en los genes H5 y N1 del genoma del virus de la gripe A, estando la sonda para la detección del gen H5 constituida por:

SEC ID Nº 7: ACACCAAGTGTCAAACTCCAAT, o su secuencia complementaria,

mientras que la sonda para la detección del gen N1 está constituida por: 5

SEC ID Nº 8: GCGAAATCACATGTGTGTGCAGGGA, o su secuencia complementaria,

comprendiendo cada secuencia al menos un medio de marcado.

10. Oligonucleótido, que se utilizará como sonda de detección de una secuencia de ácidos nucleicos amplificada que resulta de la amplificación de una secuencia diana localizada en el gen H5 del genoma del virus de la gripe A, realizándose dicha amplificación por medio de un par de oligonucleótidos de acuerdo con una cualquiera de las 10 reivindicaciones 2, 4 a 8, teniendo la sonda de detección una longitud comprendida entre 10 y 50 nucleótidos y comprendiendo al menos un fragmento de 10 nucleótidos consecutivos obtenidos de:

SEC ID Nº 7: ACACCAAGTGTCAAACTCCAAT, o su secuencia complementaria a excepción del oligonucleótido de secuencia CAT TGG AGT TTG ACA CTT GGT GTT, comprendiendo la secuencia al menos un medio de marcado. 15

11. Oligonucleótido, que se utilizará como sonda de detección de una secuencia de ácidos nucleicos amplificada resultante de la amplificación de una secuencia diana localizada en el gen N1 del genoma del virus de la gripe A, realizándose dicha amplificación por medio de un par de oligonucleótidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8, teniendo la sonda de detección una longitud comprendida entre 10 y 50 nucleótidos y comprendiendo al menos un fragmento de 10 nucleótidos consecutivos obtenidos de: 20

SEC ID Nº 8: GCGAAATCACATGTGTGTGCAGGGA, o su secuencia complementaria, comprendiendo la secuencia al menos un medio de marcado.

12. Sonda de detección, tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, caracterizada porque está constituida por una sonda molecular.

13. Sonda de detección, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, caracterizada porque está 25 constituida por una sonda molecular, constituida preferentemente por:

SEC ID Nº 9: [6-FAM]-cgatcgaCACCAAGTGTCAAACTCCAAtcgatcg-[DabSyl], para la detección del gen H5,

SEC ID Nº 10: [6-FAM]-cgatcgGCGAAATCACATGTGTGTGCAGGGAcgatcg-[DabSyl], para la detección del gen N1.

14. Utilización de uno o dos pares de oligonucleótidos, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, 30 en una reacción de amplificación de ácidos nucleicos o como sonda de detección del genoma del virus de la gripe A del que se sospecha que está presente en una muestra biológica.

15. Método de detección de ácidos nucleicos del virus de la gripe A que puede estar presente en una muestra, en el que la muestra se somete a una reacción de amplificación de ácidos nucleicos utilizando un par de oligonucleótidos, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en presencia de los reactivos de amplificación necesarios 35 para dicha amplificación y se detecta la presencia de amplicones de interés.

16. Método, de acuerdo con la reivindicación 15, caracterizado porque la reacción de amplificación utilizada es una RT-PCR.

17. Método, de acuerdo con la reivindicación 15, caracterizado porque la reacción de amplificación utilizada es una técnica de amplificación transcripcional. 40

18. Método, de acuerdo con la reivindicación 17, caracterizado porque la reacción de amplificación utilizada es la técnica NASBA.

19. Método de amplificación de dos genes H5 y N1 del virus de la gripe A que puede estar presente en una muestra, que comprende las siguientes etapas:

- incubar la muestra en un tampón de amplificación en presencia: 45

 de dos cebadores de amplificación de acuerdo con la reivindicación 2, teniendo cada uno una longitud comprendida entre 10 y 50 nucleótidos, comprendiendo uno adicionalmente una secuencia promotora, el otro de polaridad opuesta al cebador asociado a la secuencia promotora, para hibridar respectivamente cadena arriba y cadena abajo de una zona de interés localizada en el gen H5 del virus de la gripe A,

 de dos cebadores de amplificación de acuerdo con la reivindicación 3, teniendo cada uno una longitud 50 comprendida entre 10 y 50 nucleótidos, comprendiendo uno adicionalmente una secuencia promotora, el otro de polaridad opuesta al cebador asociado a la secuencia promotora, para hibridar respectivamente cadena arriba y cadena abajo de una zona de interés localizada en el gen N1 del virus de la gripe A,

- añadir los siguientes reactivos a la muestra:

 una enzima que tiene una actividad ADN polimerasa dependiente de ARN, 55

 una enzima que tiene una actividad ADN polimerasa dependiente de ADN,

 una enzima que tiene una actividad ARNasa H,

 una enzima que tiene una actividad ARN polimerasa dependiente de ADN, y

- mantener a la mezcla de reacción creada de este modo en condiciones apropiadas y durante un periodo de tiempo suficiente para que tenga lugar una amplificación.

20. Kit de detección de los genes H5 y N1 del virus de la gripe A que puede estar presente en una muestra, que 5 contiene:

- dos pares de oligonucleótidos de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 8,

- dos oligonucleótidos marcados o que pueden marcarse, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, y que tienen una secuencia de ácido nucleico sustancialmente complementaria con al menos una parte de la secuencia de ácido nucleico amplificada, 10

- los reactivos necesarios para la realización de una reacción de amplificación.

21. Kit de acuerdo con la reivindicación 20, en el que los reactivos necesarios para la realización de una reacción de amplificación son reactivos que permiten una amplificación NASBA.