MÉTODOS PARA LA SÍNTESIS DE UNA SOLUCIÓN DE HEMOGLOBINA MODIFICADA.

Un método para preparar una solución de hemoglobina PEGilada que está sustancialmente libre de contaminantes,

que comprende: (a) disolver un polietilenglicol activado (aPEG) en un disolvente adecuado para la adición a una solución de hemoglobina y en el que dicho aPEG es estable, en donde el disolvente se selecciona del grupo que consiste en etanol, metanol y acetonitrilo; (b) filtrar dicho aPEG disuelto a través de medios de filtración que reducen sustancialmente los niveles de contaminantes en la solución de aPEG filtrada resultante, en donde los medios de filtración son o incluyen un filtro de membrana de 0,2 μm; y (c) combinar asépticamente dicha solución de aPEG filtrada resultante con una solución de hemoglobina en medios de combinación, en donde la hemoglobina es hemoglobina libre de estroma purificada, y preparar dicha solución de hemoglobina PEGilada

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2002/026515.

Solicitante: APEX BIOSCIENCE, INC.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 2810 MERIDIAN PARKWAY, SUITE 120 DURHAM, NORTH CAROLINA 27713 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: TALARICO,Todd,Lewis, STACEY,Cyrus,John.

Fecha de Publicación: .

Fecha Solicitud PCT: 20 de Agosto de 2002.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C07K1/107D4
  • C07K14/805 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02;   proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › Hemoglobinas; Mioglobinas.
  • C08G65/30 C […] › C08 COMPUESTOS MACROMOLECULARES ORGANICOS; SU PREPARACION O PRODUCCION QUIMICA; COMPOSICIONES BASADAS EN COMPUESTOS MACROMOLECULARES.C08G COMPUESTOS MACROMOLECULARES OBTENIDOS POR REACCIONES DISTINTAS A AQUELLAS EN LAS QUE INTERVIENEN SOLAMENTE ENLACES INSATURADOS CARBONO - CARBONO (procesos de fermentación o procesos que utilizan enzimas para sintetizar un compuesto dado o una composición dada o para la separación de isómeros ópticos a partir de una mezcla racémica C12P). › C08G 65/00 Compuestos macromoleculares obtenidos por reacciones que forman un enlace éter en la cadena principal de la macromolécula (resinas epoxi C08G 59/00; politioéter-poliéteres C08G 75/12; poliéteres que contienen menos de once unidades monómeras C07C). › Tratamiento posterior a la polimerización, p. ej. recuperación, purificación, secado.

Clasificación PCT:

  • A61K38/42 SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE.A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L;   composiciones a base de jabón C11D). › A61K 38/00 Preparaciones medicinales que contienen péptidos (péptidos que contienen ciclos beta-lactama A61K 31/00; dipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina 2,5-dionas, A61K 31/00; péptidos basados en la ergolina A61K 31/48; que contienen compuestos macromoleculares que tienen unidades aminoácido repartidas estadísticamente A61K 31/74; preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos A61K 39/00; preparaciones medicinales caracterizadas por los ingredientes no activos, p. ej. péptidos como soportes de fármacos, A61K 47/00). › Hemoglobinas; Mioglobinas.
  • A61L2/00 A61 […] › A61L PROCEDIMIENTOS O APARATOS PARA ESTERILIZAR MATERIALES U OBJECTOS EN GENERAL; DESINFECCION, ESTERILIZACION O DESODORIZACION DEL AIRE; ASPECTOS QUIMICOS DE VENDAS, APOSITOS, COMPRESAS ABSORBENTES O ARTICULOS QUIRURGICOS; MATERIALES PARA VENDAS, APOSITOS, COMPRESAS ABSORBENTES O ARTICULOS QUIRURGICOS (conservación de cuerpos o desinfección caracterizada por los agentes empleados A01N; conservación, p. ej. esterilización de alimentos o productos alimenticios A23; preparaciones de uso medico, dental o para el aseo A61K). › Procedimientos o aparatos para desinfectar o esterilizar materiales u objetos distintos a los productos alimenticios y a las lentes de contacto; Sus accesorios (pulverizadores de desinfectantes A61M; esterilización de envases o del contenido del envase asociado a su contenedor B65B 55/00; tratamiento del agua, agua residual o de alcantarilla C02F; desinfección del papel D21H 21/36; dispositivos de desinfección para retretes E03D; artículos que incluyen accesorios para la desinfección, ver las subclases apropiadas para estos artículos, p. ej. H04R 1/12).
  • A61L2/02 A61L […] › A61L 2/00 Procedimientos o aparatos para desinfectar o esterilizar materiales u objetos distintos a los productos alimenticios y a las lentes de contacto; Sus accesorios (pulverizadores de desinfectantes A61M; esterilización de envases o del contenido del envase asociado a su contenedor B65B 55/00; tratamiento del agua, agua residual o de alcantarilla C02F; desinfección del papel D21H 21/36; dispositivos de desinfección para retretes E03D; artículos que incluyen accesorios para la desinfección, ver las subclases apropiadas para estos artículos, p. ej. H04R 1/12). › que utilizan fenómenos físicos.
  • C07K1/00 C07K […] › Procedimientos generales de preparación de péptidos.

Clasificación antigua:

  • C07K1/00 C07K […] › Procedimientos generales de preparación de péptidos.

Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania, Letonia, Ex República Yugoslava de Macedonia, Albania.

PDF original: ES-2357941_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere a métodos para la purificación de una solución de polietilenglicol activado y para la síntesis de una solución de hemoglobina modificada. 5

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ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La sangre es el líquido circulante que transporta oxígeno y materiales nutritivos a los tejidos del cuerpo y retira dióxido de carbono y otros productos metabólicos y residuos para la excreción. La sangre consiste en un fluido, el plasma, en el que está suspendida una variedad de componentes incluyendo los glóbulos rojos. Stedman's Medical Dictionary, 26ª edición, página 214 (1995). Un componente particularmente importante de los glóbulos rojos es la 10 proteína hemoglobina, que es específicamente responsable del transporte de oxígeno desde los pulmones a otros tejidos del cuerpo.

Debido a la gran demanda de sangre en los Estados Unidos y en todo el mundo, se han dirigido intensos esfuerzos de investigación al desarrollo de sustitutos de sangre basados en hemoglobina. Tales sustitutos se han producido con una variedad de modificaciones de hemoglobina purificada a fin de prevenir la toxicidad o potenciar de otro 15 modo las propiedades de la molécula, usando una clase particularmente importante de modificación efectuada moléculas de la familia del polietilenglicol (PEG) que se han activado (aPEG) de modo que son capaces de modificar químicamente proteínas. Tal PEGilación es importante debido a que altera favorablemente la actividad, la solubilidad, la semivida en circulación in vivo, la toxicidad y la inmunogenicidad de las hemoglobinas. Véanse, generalmente, Delgado et ál. (1992) Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Sys. 9:249-304; Greenwald et ál. (2000) Crit. Rev. 20 Ther. Drug Carrier Sys. 17: 101-161.

La bibliografía revela que la hemoglobina se ha PEGilado usando una variedad de compuestos de aPEG. Un compuesto de aPEG usado para modificar la hemoglobina es la molécula de PEG activado polioxietileno (α-carboximetil, ω-carboximetoxipolioxietileno) (POE), que se hace reaccionar con hemoglobina piridoxilada para obtener hemoglobina piridoxilada-polioxietileno (PHP). Talarico et ál. (1999) Biochem. et Biophys. Acta 1476:53-65, 25 incorporado en la presente memoria mediante referencia. Las hemoglobinas modificadas con POE son de particular interés debido a que contienen proteínas celulares que potencian su funcionalidad como eliminadores de óxido nítrico (NO), un compuesto implicado en una variedad de enfermedades. Así, existe un gran uso potencial de tales PHPs como agentes terapéuticos para el tratamiento de enfermedades ligadas a la presencia de NO en exceso, incluyendo, por ejemplo, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), una dolencia médica crítica que es 30 refractaria a las terapias existentes. Privalle et ál. (2000) Free Radic. Biol. Med. 28:1507-17, incorporado en la presente memoria mediante referencia.

Aunque el PHP y otras hemoglobinas PEGiladas son muy prometedoras en estas y otras aplicaciones terapéuticas, existe un número de problemas que afectan a tales usos, notablemente la presencia de compuestos contaminantes que afectan a su seguridad o eficacia. Virus peligrosos tales como el HIV/virus del sida o virus de hepatitis, por 35 ejemplo, a menudo contaminan la sangre entera usada para preparar la fracción de hemoglobina usada en la PEGilación, y deben retirarse en algún punto durante la preparación del producto final PEGilado mediante filtración u otros medios. Adicionalmente, biocarga tal como bacterias puede ser una fuente de contaminación bien de la hemoglobina o bien de materiales de partida tales como un aPEG, como lo pueden ser las endotoxinas, las macromoléculas complejas de lipopolisacáridos (LPS) de la pared celular de bacterias Gram negativas que pueden 40 provocar fiebre, diarrea, choque hemorrágico y otros daños tisulares. Stedman's Medical Dictionary, 26ª edición, página 572 (1995).

La biocarga y las endotoxinas son una fuente particularmente problemática de contaminación debido a la falta de métodos adecuados para retirarlas de la materia prima de aPEG usada en la PEGilación. Según se analizaba previamente, las moléculas de aPEG son moléculas activada de la familia del polietilenglicol. Muchas de tales 45 moléculas activadas son lábiles en agua y, como resultado, típicamente se añaden a la fracción de hemoglobina en una forma en polvo, en vez de en solución. Aunque los aPEGs en esta forma son relativamente estables, como polvos no pueden procesarse para la retirada de contaminantes usando los métodos disponibles para aPEGs disueltos, tales como las técnicas de filtración. Aunque estos contaminantes pueden retirarse después de la PEGilación, tal retirada tiene consecuencias no deseables. Por ejemplo, aunque las endotoxinas pueden retirarse 50 del PHP mediante cromatografía, tal cromatografía da como resultado cambios no deseables en la composición proteínica del PHP.

Así, existe desde hace mucho tiempo una necesidad de un método para purificar aPEGs para el uso con moléculas peptídicas y polipéptidos tales como hemoglobina. Por otra parte, existe desde hace mucho tiempo una necesidad

de métodos para usar tales aPEGs disueltos purificados en la PEGilación de péptidos y polipéptidos tales como hemoglobina, en los que el disolvente en el que está disuelto el aPEG no dé como resultado la desnaturalización o la degradación sustancial del péptido o polipéptido tal como hemoglobina.

La Patente de EE. UU. Nº 5.224.903 muestra un método para producir una solución de hemoglobina químicamente modificada usando un aPEG, seguido por filtración y esterilización para retirar contaminantes. El aPEG se añade a 5 la fracción de hemoglobina como un polvo. La Publicación Internacional Nº WO 90/15613 muestra la preparación de hemoglobina libre de virus usando un aPEG no purificado.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona un método para preparar una solución de hemoglobina PEGilada que está sustancialmente libre de contaminantes. El método comprende disolver un aPEG en un disolvente adecuado para la 10 adición a una solución de hemoglobina y en el que el aPEG es estable, filtrar el aPEG disuelto a través de medios de filtración que reducen sustancialmente los niveles de contaminantes en la solución de aPEG filtrada resultante, y combinar la solución de aPEG filtrada resultante con una solución de hemoglobina en medios de combinación. Más específicamente, el método comprende:

(a) disolver un polietilenglicol activado (aPEG) en un disolvente adecuado para la adición a una solución de 15 hemoglobina y en el que dicho aPEG es estable, en donde el disolvente se selecciona del grupo que consiste en etanol, metanol y acetonitrilo;

(b) filtrar dicho aPEG disuelto a través de medios de filtración que reducen sustancialmente los niveles de contaminantes en la solución de aPEG filtrada resultante, en donde los medios de filtración son o incluyen un filtro de membrana de 0,2 μm; y 20

(c) combinar asépticamente dicha solución de aPEG filtrada resultante con una solución de hemoglobina en medios de combinación, en donde la hemoglobina es hemoglobina libre de estroma purificada, y preparar dicha solución de hemoglobina PEGilada.

En una realización de la presente invención, el aPEG usado es POE.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS 25

La Figura 1 es una visión de conjunto esquemática de la síntesis de PHP.

La Figura 2 muestra el perfil de elución de una formulación final de PHP preparada con POE en polvo, según se determinaba mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC).

La Figura 3 muestra el perfil de elución de una formulación final de PHP preparada con solución de POE/etanol filtrada, según se determinaba mediante SEC. 30

La Figura 4 muestra una superposición de los perfiles de las Figuras 2 y 3 con una sensibilidad de aproximadamente dos veces la mostrada en las Figuras 2 y 3.

La Figura 5 muestra los datos de la Figura 4, confinados a la vecindad de la fracción de alto peso molecular del perfil de elución de SEC y con una sensibilidad de aproximadamente 100 veces la de la Figura 4.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN 35

El método de la presente invención abarca la preparación de una solución de aPEG que está sustancialmente... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método para preparar una solución de hemoglobina PEGilada que está sustancialmente libre de contaminantes, que comprende:

(a) disolver un polietilenglicol activado (aPEG) en un disolvente adecuado para la adición a una solución de hemoglobina y en el que dicho aPEG es estable, en donde el disolvente se selecciona del grupo que consiste 5 en etanol, metanol y acetonitrilo;

(b) filtrar dicho aPEG disuelto a través de medios de filtración que reducen sustancialmente los niveles de contaminantes en la solución de aPEG filtrada resultante, en donde los medios de filtración son o incluyen un filtro de membrana de 0,2 μm; y

(c) combinar asépticamente dicha solución de aPEG filtrada resultante con una solución de hemoglobina en 10 medios de combinación, en donde la hemoglobina es hemoglobina libre de estroma purificada, y preparar dicha solución de hemoglobina PEGilada.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el aPEG es polioxietileno (POE) activado.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los medios de filtración reducen sustancialmente los niveles contaminantes de endotoxinas en la solución de aPEG filtrada. 15

4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que los medios de filtración reducen los niveles contaminantes de endotoxinas en la solución de aPEG filtrada en al menos 500 EU/cm2 de área del filtro.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los medios de filtración comprenden un filtro de nailon de 0,2 m.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la solución de hemoglobina comprende hemoglobina 20 piridoxilada libre de estroma.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los medios de filtración y los medios de combinación están unidos asépticamente.


 

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