Un método para producir un anticuerpo, el cual reacciona de forma cruzada con productos de gen del receptor similar a Ig exterminador KIR2DL múltiples y el cual neutraliza la actividad inhibidora de productos de gen KIR2DL de este tipo,

comprendiendo dicho método las etapas de: (a) inmunizar un mamífero no humano con un inmunógeno que comprende un polipéptido KIR2DL; (b) preparar anticuerpos a partir de dicho mamífero inmunizado, en donde dichos anticuerpos se enlazan a dicho polipéptido KIR2DL1 y KIR2DL2/3, (c) seleccionar anticuerpos de (b) que tienen una reacción cruzada con al menos dos productos de gen KIR2DL diferentes; (d) seleccionar anticuerpos de (c) que potencian las células NK; y (e) seleccionar un anticuerpo que enlaza una célula NK o polipéptido KIR de primate

CAMPO DE LA INVENCION

La presente invención se refiere a anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y derivados de éstos que reaccionan con dos o más receptores inhibidores presentes en la superficie celular de células NK y potencian la citotoxicidad de las células NK en sujetos mamíferos o en una muestra biológica. La invención también se refiere a métodos de producción de los 5 anticuerpos, fragmentos, variantes y derivados; a composiciones farmacéuticos que comprenden los mismos; y al uso de las moléculas y composiciones, particularmente en terapia, para aumentar la actividad de células NK o citotoxicidad en sujetos.

ANTECEDENTES

Las células exterminadoras naturales (NK por sus siglas en inglés) son una sub-población de linfocitos, involucrados en 10 inmunidad no convencional. Las células NK se pueden obtener por diversas técnicas conocidas en la técnica, tales como a partir de muestras de sangre, citaferesis, colecciones, etc.

Las propiedades características y biológicas de las células NK incluyen la expresión de antígenos de superficie que incluyen CD16, CD56, y/o CD57; la ausencia del complejo alfa/beta o gamma/delta TCR en la superficie de la célula; la capacidad para unirse a y exterminar células que fallan para expresar “auto” antígenos MHC/HLA mediante la activación 15 de enzimas citolíticas específicas; la capacidad para eliminar células de tumores u otras células enfermas que expresan un ligando receptor que activa NK; la capacidad para liberar citocinas que estimulan o inhiben la respuesta inmune; y la capacidad para someter rondas múltiples de división de células y producir células hijas con propiedades biológicas similares a la célula precursora. Dentro del contexto de esta invención las células NK “activas” designan células NK biológicamente activas, más particularmente células NK que tienen la capacidad de lisar células diana. Por ejemplo, una 20 célula NK “activa” es capaz de exterminar células que expresan un ligando receptor de activación NK y fallan en expresar “auto” antígenos MHC/HLA (células incompatibles con KIR).

Con base en sus propiedades biológicas, se han propuesto varias estrategias terapéuticas y de vacuna en la técnica, que se basan en una modulación de células NK. Sin embargo, la actividad de las células NK se regula por un mecanismo complejo que involucra tanto las señales de estimulación como las inhibidoras. En consecuencia, la terapia 25 mediada por células NK efectiva puede requerir tanto de una estimulación de estas células como de una neutralización de los signos inhibidores.

Las células NK se regulan negativamente por receptores inhibidores específicos del complejo principal de histocompatibilidad (MHC por sus siglas en inglés) clase I (Kärre y colaboradores, 1986; Öhlén y colaboradores, 1989). Estos receptores específicos se unen a determinantes polimórficos de moléculas MHC clase I o HLA presentes en otras 30 células e inhiben la lisis de células NK. En seres humanos, ciertos miembros de una familia de receptores llamados receptores similares a Ig exterminadores (KIR) reconocen grupos de alelos HLA clase I.

Los KIR son una familia grande de receptores presentes en ciertos subconjuntos de linfocitos, que incluyen células NK. La nomenclatura para los KIRS está basada en el número de dominios extracelulares (KIR2D o KIR3D) y si la cola citoplásmica es larga (KIR2DL o KIR3DL) o corta (KIR2DS o KIR3DS). Dentro de seres humanos, la presencia o 35 ausencia de un KIR dado es variable de una célula NK a otra dentro de la población de NK presente en un individuo único. Dentro de la población humana también hay un nivel relativamente alto de polimorfismo de las moléculas KIR, estando ciertas moléculas KIR presentes en algunos, pero no en todos los individuos. Ciertos productos de gen KIR provocan estimulación de actividad de linfocitos cuando se unen a un ligando apropiado. Todos los KIRS estimuladores confirmados tienen una cola citoplásmica corta con un residuo de transmembrana cargado que se asocia con una 40 molécula adaptadora que tiene un motivo inmunoestimulador (ITAM). Otros productos de gen KIR son inhibidores por naturaleza. Todos los KIRS inhibidores confirmados tienen una cola citoplásmica larga y aparentan interactuar con subconjuntos diferentes de antígenos HLA dependiendo del subtipo KIR. Los KIRS inhibidores exhiben en su porción intracitoplásmica uno o varios motivos inhibidores que reclutan fosfatasas. Los receptores KIR inhibidores conocidos incluyen miembros de las subfamilias KIR2DL y KIR3DL. Los receptores KIR que tienen dos dominios Ig (KIR2D) 45 identifican alotipos HLA-C: KIR2DL2 (anteriormente designado p58.2) o el producto de gen KIR2DL3 estrechamente relacionado reconoce un epítopo formado por el grupo 2 de alotipos HLA-C (Cw1, 3, 7 y 8), mientras que KIR2DL1 (p58.1) reconoce un epítopo compartido por el grupo recíproco 1 de alotipos HLA-C (Cw2, 4, 5 y 6). El reconocimiento por KIR2DL1 viene dictado por la presencia de un residuo Lys en la posición 80 de los alelos HLA-C. El reconocimiento de KIR2DL2 y KIR2DL3 se dicta por la presencia de un residuo Asn en la posición 80. Importantemente, la gran mayoría 50 de los alelos HLA-C tienen un residuo Asn o un residuo Lys en la posición 80. Un KIR con tres dominios Ig, KIR3DL1 (p70), reconoce un epítopo compartido por alelos HLA-Bw4. Finalmente, un homodímero de moléculas con tres dominios KIR3DL2 de Ig (p140) reconoce HLA-A3 y –A11.

Aunque los KIRS inhibidores y otros receptores inhibidores clase I (Moretta y colaboradores, 1997; Valiante y colaboradores, 1997a; Lanier, 1998) pueden ser co-expresados por células NK, en cualquier repertorio de NK del 55 individuo dado hay células que expresan un KIR único y así, las células NK que correspondientes son bloqueadas solamente por células que expresan un grupo de alelo clase I específico.

La población de células NK o clones que son no coincidentes con KIR, esto es, población de células NK que expresan

KIR que no son compatibles con unas moléculas HLA de un hospedador, han demostrado ser los mediadores más probables del efecto de antileucemia de injerto visto en el trasplante alogénico (Ruggeri y colaboradores, 2002). Una forma de reproducción de este efecto en un individuo dado puede ser usar reactivos que bloqueen la interacción KIR/HLA.

Anticuerpos monoclonales específicos para KIR2DL1 han demostrado bloquear la interacción de KIR2DL1 con alelos 5 Cw4 (o similares) (Moretta y colaboradores, 1993). También se ha descrito que los anticuerpos monoclonales contra KIR2DL2/3 bloquean la interacción de KIR2DL2/3 con alelos HLACw3 (o similares) (Moretta y colaboradores, 1993). Sin embargo, el uso de reactivos de este tipo en situaciones clínicas podría requerir el desarrollo de dos mAbs terapéuticos para tratar todos los pacientes, sin considerar si cualquier paciente dado estuvo expresando alelos HLA-C clase 1 ó clase 2. Más aún, uno podría predeterminar qué tipo de HLA fue expresado por cada paciente antes de decidir qué 10 anticuerpo terapéutico usar, resultando así en un costo mucho mayor del tratamiento.

Watzl y colaboradores, Tissue Antigens, 56, p. 240 (2000) produjeron anticuerpos de reacción cruzada que reconocen isotipos múltiples de KIRS, pero aquellos anticuerpos no exhibían una potenciación de la actividad de células NK. G. M. Spaggiara y colaboradores, Blood, 100, pp. 4098-4107 (2002) llevó a cabo experimentos que utilizan numerosos anticuerpos monoclonales contra diversos KIRS. Uno de esos anticuerpos, NKVSF1, era aquel que reconocía un 15 epítopo común de CD158a (KIR2DL1), CD158b (KIR2DL2) y p50.3 (KIR2DS4). Esto no sugiere que NKVSF1 pueda potenciar la actividad de las células NK y no existe sugerencia de que este pueda ser usado como un agente terapéutico. En consecuencia, enfoques prácticos y efectivos en la modulación de la actividad de células NK no están hasta ahora disponibles en la técnica y todavía requieren una intervención específica del alelo HLA usando reactivos específicos. 20

SUMARIO DE LA INVENCION

El alcance de la presente invención se define por las reivindicaciones y cualquier información que no caiga dentro de las reivindicaciones se proporciona sólo para información.

La presente descripción proporciona ahora anticuerpos, composiciones y métodos nuevos que superan las dificultades actuales en la activación de células NK y proporcionan características y beneficios ventajosos adicionales. En un 25 aspecto ejemplar, la descripción proporciona... [Seguir leyendo]

1. Un método para producir un anticuerpo, el cual reacciona de forma cruzada con productos de gen del receptor similar a Ig exterminador KIR2DL múltiples y el cual neutraliza la actividad inhibidora de productos de gen KIR2DL de este tipo, comprendiendo dicho método las etapas de:

(a) inmunizar un mamífero no humano con un inmunógeno que comprende un polipéptido KIR2DL; 5

(b) preparar anticuerpos a partir de dicho mamífero inmunizado, en donde dichos anticuerpos se enlazan a dicho polipéptido KIR2DL1 y KIR2DL2/3,

(c) seleccionar anticuerpos de (b) que tienen una reacción cruzada con al menos dos productos de gen KIR2DL diferentes;

(d) seleccionar anticuerpos de (c) que potencian las células NK; y 10

(e) seleccionar un anticuerpo que enlaza una célula NK o polipéptido KIR de primate.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el primate en la etapa (e) es un mono cynomolgus.

3. Un método para evaluar la toxicidad de un anticuerpo, en el que el anticuerpo producido de acuerdo con el método de cualaquiera de las reivindicaciones 1 a 2 se administra a un primate no humano.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el primate es un mono cynomolgus. 15

FIGURA 12

Regiones variables ligeras de anti-KIR

DF-200 variable ligero

NKVSF1 variable ligero

Consenso

DF-200 variable ligero

NKVSF1 variable ligero

Consenso

DF-200 variable ligero

NKVSF1 variable ligero

Consenso

Los números por encima de la secuencias de aminoácidos indican las posiciones con respecto al inicio de la traducción de Met(+1) en la inmunoglobulina inmadura (no secretada). Las regiones CDR están subrayadas.

CDRs de las regiones variables ligeras anti-KIR

CDR-L1 procedentes de los clones DF-200

Residuos antes: Normalmente Cys. Residuos después Trp. Típicamente Trp-Tyr-Leu. Longitud: 10-17 aminoácidos

Comienzo: aproximadamente 24 aminoácidos desde el comienzo de la proteína secretada

DF-200 variable ligero

NKVSF1 variable ligero

Consenso

CDR-L2 procedentes de los clones DF-200

Residuos antes: Generalmente Ile-Tyr

Longitud: 7 aminoácidos

Comienzo: aproximadamente 16 aminoácidos después del final de CDR-L1

DF-200 variable ligero

NKVSF1 variable ligero

Consenso

CDR-L3 procedentes de los clones DF-200

Residuos antes: Cys

Residuos después: Phe-Gly-XXX-Gly

Longitud: 7-11 aminoácidos

Comienzo: aproximadamente 33 aminoácidos después del final de CDR-L2

DF-200 variable ligero

NKVSF1 variable ligero

Consenso

FIGURA 13

>DF-200\VH\PROT-inmadura

MAVLGLLFCLVTFPSCVLS

Regiones variables pesadas anti-KIR (Fabs inmaduros)

Secuencias que incluyen regiones CDR en regiones variables pesadas

CDR-H1 procedentes del clon DF-200

Residuos antes: Cys-XXX-XXX-XXX

Residuos después: Trp. Generalmente Trp-Val o Trp-Ile

Longitud: 10-14 aminoácidos

Comienzo: aproximadamente 22-26 aminoácidos desde el comienzo de la proteína secretada

CDR-H2 procedentes del clon DF-200

Residuos antes: Leu-Glu-Trp-Ile-Gly, pero posibles otras variaciones

Residuos después: Lys o Arg / Leu o Ile o Val o Phe o Thr o Ala / Thr o Ser o Ile o Ala

Longitud: 16-20 aminoácidos

Comienzo: aproximadamente 15 aminoácidos después del final de CDR-H1

CDR-H3 procedentes de los clones 4G1, 5D5 y 6C12

Residuos antes: Cys-XXX-XXX (Típicamente Cys-Ala-Arg)

Residuos después: Trp- Gly- XXX-Gly

Longitud: 3-25 aminoácidos

Comienzo: aproximadamente 33 aminoácidos después del final de CDR-H2

El VH secretado, maduro comienza en:

Posición 20: residuo Q

La región VH termina con el residuo S y después continúa la región constante (no mostrada)