Un método para identificar un estado celular que comprende: proporcionar una serie de receptáculos conteniendo cada uno células a investigar;

someter dichas células en receptáculos diferentes a diferentes condiciones de tratamiento generándose dichas condiciones de tratamiento diferentes con diferentes agentes y seleccionándose dichos agentes a partir de pequeñas moléculas y proteínas; esperar un periodo predeterminado de tiempo antes de analizar dichas células; detectar la expresión de al menos 5 marcadores en dichas células siendo dichos marcadores receptores o ligandos y haciéndose dicha detección con la ayuda de un anticuerpo y un marcador fluorescente; crear un espectro que represente la expresión de marcadores de una población celular y usar aglomeración jerárquica para representar los datos en forma de una matriz de similitud organizada para generar regiones de similitud a lo largo de una diagonal, donde el algoritmo de aglomeración jerárquica usa la distancia Euclidiana entre los espectros para obtener una medida de similitud y ordenar las medidas entre todos los espectros del experimento proporciona un gráfico Tartán y donde cada aglomerado es indicativo de un estado celular posible

CAMPO DE LA INVENCIÓN

Esta invención se refiere generalmente a métodos para identificar uno o más agentes. En particular, esta invención pertenece a métodos para identificar condiciones que promueven, permiten, inhiben o mantienen ciertos estados celulares.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las células diferenciadas comienzan su vida como células pluripotentes, típicamente denominadas células madre. Las células madre pluripotentes son células que todavía no se han asignado a un determinado fenotipo. El término "pluripotente" se refiere a esta capacidad, es decir, la capacidad de una célula madre de diferenciarse en cualquier número de células maduras. Por ejemplo, las células madre de la médula ósea pueden formar glóbulos rojos o glóbulos blancos dependiendo del ingrediente químico al que se expongan estas células. Los factores particulares o conjuntos de factores actúan sobre la célula madre dirigiéndolas hacia un determinado fenotipo. Dependiendo de qué factores o conjunto de factores actúan sobre una célula madre particular, la célula madre se diferenciará en una célula madura comprometida, tal como un linfocito T. A menudo no sólo es un factor el que determina el destino de una célula madre. Típicamente, es una combinación de factores que promueve una vía de diferenciación particular. La Figura 6 ilustra un proceso de diferenciación típico a partir de una célula madre. Por tanto, las células pueden tener múltiples vías diferentes. Las flechas indican sitios potenciales para qué las células se diferencian, desdiferencian, transdiferencian o regeneran.

A menudo determinadas poblaciones de células desempeñan un papel crítico en, por ejemplo, en la lucha contra enfermedades. Por ejemplo, los glóbulos blancos como un total los emplea el cuerpo para luchar contra bacterias, virus e invasiones parasíticas. Dentro del agrupamiento de glóbulos blancos hay células específicas que tienen funciones particulares. Por ejemplo, el sistema de inmunidad específica está compuesto linfocitos. Los linfocitos pueden ser linfocitos T o linfocitos B. Los primeros se pueden subdividir en, por ejemplo, células T auxiliares y citotóxicas. Los últimos, los linfocitos B se pueden diferenciar adicionalmente en células de memoria o células plasmáticas (células que producen proteínas solubles denominadas anticuerpos). Todas estas células tienen fenotipos específicos asociados con las mismas; además también pueden compartir algunas características. Alguna de las características fenotípicas son antígenos particulares que se producen en la superficie de una célula diferenciada. Por ejemplo, las células T auxiliares producen un antígeno denominado CD4, mientras que las células T citotóxicas producen un antígeno CD8. Estos antígenos permiten un método para identificar ampliamente una población celular. Incluso algunos tipos celulares se pueden identificar por un marcador, puede que no todas las células de una población de células que expresan un marcador funcionen igual. Por tanto, no todas las células T citotóxicas CD8 responderán a los antígenos igual. Una población de células T citotóxicas CD8 consistirá en células en estados celulares variables incluso aunque todas las células puedan expresar CD8. Por tanto, todas las células de una población pueden ser positivas para CD8, pero pueden variar en la expresión de múltiples marcadores distintos o en la secreción de factores. Sería deseable identificar los estados celulares de diferentes de células que expresan CD8 para determinar qué factores producen ese estado celular y en que se diferencia este estado celular de otros estados celulares. De la misma manera, es deseable caracterizar el estado celular para muchos otros tipos celulares.

Las células del sistema inmune, específicas de antígeno o no, experimentan diferenciación celular. Los factores celulares influyen la vía específica de diferenciación. Algunos de los factores celulares asociados con diferenciación celular particular ya se han esclarecido. En un entorno terapéutico, es deseable tener la capacidad de aislar células madre y dirigirlas hacia un cierto fin, por ejemplo, la producción de células T auxiliares. Aunque se han identificado los factores individuales que influyen en la diferenciación o pequeñas combinaciones de factores que influyen en la diferenciación, no se ha caracterizado la combinación compleja de factores o condiciones que afectan a la diferenciación celular y el estado celular. Por ejemplo, se puede conocer que la interleucina 6 provoca los efectos de diferenciación sobre las células T citotóxicas CD8, pero no se sabe que mezcla de factores generan las células T citotóxicas CD8 que tienen la respuesta más intensa frente a antígeno.

Para algunas condiciones clínicas, puede no ser deseable hacer que una célula no diferenciada se diferencie. También puede ser deseable desdiferenciar una célula, por ejemplo ir de una célula diferenciada a una célula desdiferenciada. Se conocen pocos factores celulares individuales implicados en este proceso. La desdiferenciación celular es probable que implique una mezcla compleja de factores celulares y no uno o dos factores individuales que se puedan identificar fácilmente. En otras condiciones clínicas, puede ser deseable provocar la transdiferenciación, por ejemplo, ir de un tipo de célula diferenciada a otro tipo de célula diferenciada. Este proceso puede convertir una célula madura en otras células maduras que tienen un fenotipo diferente. De manera similar, la transdiferenciación celular es probable que implique una mezcla compleja de factores celulares y no uno o dos factores individuales que se puedan identificar fácilmente.

La exploración tradicional para el esclarecimiento de diversos factores celulares responsables de la diferenciación celular a menudo es tediosa y requiere mucho trabajo. Además, la exploración de alto rendimiento tradicional respecto a la actividad de factores implica el ensayo de factores individuales. El ensayo de múltiples factores puede ser muy difícil para un sistema que no sólo ensaya la diferenciación celular, pero también ensaya respecto al estado celular. Por ejemplo, si se ensayan 5 factores diferentes a tres concentraciones diferentes combinadas en tríos en dos dimensiones temporales diferentes, se tendrían 7.110 experimentos posibles si se comprobara un resultado. El número de experimentos aumentaría a 28.440 si se comprobaran cuatro resultados. El ensayo de una combinación compleja de factores y la búsqueda de múltiples estados celulares en tipos específicos de células no se pueden conseguir con sistemas farmacéuticos tradicionales de alto rendimiento. Los sistemas de alto rendimiento actuales están limitados típicamente en variedad de entradas o variedad de salidas. Por tanto, los sistemas actuales no dirigen de manera adecuada el gran espacio experimental en relación con el estado celular. Se necesita un nuevo tipo de sistema que pueda analizar los datos de entrada y la salida del complejo y agrupar los datos en un formato que se pueda leer.

Cada una de las técnicas mencionadas anteriormente debe estar acoplada con una forma de análisis de datosy técnicas de manipulación para permitir la recolección y procesamiento de datos de cientos o miles de muestras. Éstas y otras dificultades se superan por los métodos descritos en el presente documento.

El documento US 6.468.476 proporciona métodos para una detección potenciada de patrones de respuesta biológica (estados celulares). Dichas respuestas se agrupan de acuerdo con la similitud de su perfil biológico. Los métodos descritos son útiles en el descubrimiento de fármacos. Los métodos se pueden usar para comparar las respuestas biológicas con sensibilidad muy potenciada. El documento describe entre otros células de levadura en crecimiento en presencia de al menos 18 agentes diferentes (por ejemplo FK506, concentraciones diferentes del mismo); el análisis de la expresión de marcadores (expresión génica) después de un periodo predeterminado de tiempo (crecimiento de las células de levadura a una DO600 de 1) y el análisis de los datos de expresión por análisis de aglomerados (se seleccionan 48 de entre 6000 genes). El agrupamiento de los genes se representa en un gráfico. El agrupamiento de marcadores con expresión similar comprende el cálculo de las distancias Euclidianas entre genes y perfiles para identificar marcadores covariables. El patrón mostrado en la Figura 16 se interpreta como un "Gráfico de Tartán" puesto que muestra un patrón de tartán. El documento US 6.468.476 proporciona una guía... [Seguir leyendo]