MÉTODO PARA PRODUCIR ENDONUCLEASAS ALTAMENTE SENSIBLES, NUEVAS PREPARACIONES DE ENDONUCLEASAS Y USOS DE LAS MISMAS.

Un método para producir una endonucleasa recombinante especifica de emparejamientos erróneos en el que dicho método comprende:

- expresar dicha endonucleasa recombinante en células de una planta hospedadora completa o de un órgano separado de esta, transformada transitoriamente por agroinfiltración con una cepa de Agrobacterium que contiene un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica dicha endonucleasa; - aislar dicha endonucleasa recombinante de dichas células de la planta hospedadora

La invención se refiere a la identificación y preparación de endonucleasas específicas de emparejamiento erróneo que tienen una actividad y sensibilidad elevada y una amplia especificidad de sustrato.

A comienzos del último siglo, el descubrimiento de la posibilidad de inducir mutaciones en el ADN por radiaciones o productos químicos ha aportado una considerable expectativa para comprender la función de genes in vivo. Desde entonces, la mutagénesis y la variación de secuencias naturales se han usado ampliamente para identificar nuevas funciones, genes correspondientes a una función específica así como sitios activos dentro de una proteína específica.

Un aspecto critico para la implementación de esta estrategia, en particular en el caso de mutaciones puntuales, es la elección de métodos de detección de mutaciones que se diseñan para seleccionar grandes tramos de ADN sin reducir la sensibilidad o especificidad del diagnóstico, proporcionando al mismo tiempo información sobre la localización de la mutación. Entre las herramientas y métodos más usados están los basados en el ADN defectuosamente emparejado que podría crearse in vitro por desnaturalización y renaturalización de dos moléculas de ADN. Los emparejamientos erróneos se detectan en estas moléculas heteroduplex usando productos químicos como aglutinantes o moléculas de surcos que pueden escindir específicamente el ADN monocatenario en el sitio de emparejamiento erróneo. Como alternativa, se han usado endonucleasas específicas monocatenarias para escindir en ADN en el sitio de emparejamiento erróneo. La mayoría de las endonucleasas descritas en este documento pertenecen ahora a la clase de nucleasas S1/P1.

Se sabe que nucleasas tales como S1, P1 y la nucleasa de frijol chino, pertenecientes a la misma familia denominada: “familia de nucleasas S1/P1” o “familia de nucleasas S1” escinden el ADN en regiones de una sola cadena. Sin embargo, estas nucleasas tienen un pH óptimo ácido en el intervalo de 4,0-5,0.

Esto es desventajoso para detectar emparejamientos erróneos, ya que valores bajos de pH favorecen la despurinización del ADN y desestabilizan los duplex de ADN, lo que conduce a una degradación no específica de ADN y reduce la sensibilidad y especificidad en la detección.

Hace algunos años, en extractos de diversas plantas, OLEYKOWSKI et al. (Nucleic Acids Res, 26, 4597-4602, 1998) detectaron una actividad endonucleasa de emparejamiento erróneo que tenia un pH óptimo neutro (aproximadamente pH 8) y que realizaba una escisión en una sola cadena en el lado 3' de un sitio de emparejamiento erróneo. Estos autores describieron que esta actividad endonucleasa de emparejamiento erróneo se asociaba con manoxil glucoproteínas en extractos de brotes de alfalfa, espárragos, apio y tomate. La enzima procedente del apio, denominada CEL I, se purificó de los tallos del apio por etapas sucesivas de precipitación en sulfato de amonio, unión a una columna de agarosa-concavalina A y elución mediante ºalfaº-d+-manosa, unión a una columna de fosfocelulosa y elución mediante un gradiente lineal de KCI, y fraccionamiento por cromatografía de exclusión de tamaño. La preparación de CEL I obtenida de esta manera contenía diversas bandas de proteínas de 34-39 kDa.

En YANG et al., (Biochemistry, 39, 3533-3541, 2000) y en la solicitud PCT documento WO 01/62974 se describe una purificación de CEL I mejorada mediante el uso de alfametil-manosido en los tampones de purificación para superar la agregación de CEL I con lecitinas endógenas. Estos documentos también describen la clonación del ADNc de CEL I. Basándose en datos de secuencias, CEL I se asignó a una subfamilia de la familia de nucleasas S1/P1 y se identificaron diversos posibles homólogos codificados por los genes BFN 1 de Arabidopsis (nucleótido de GenBank AY040016), ZEN 1 de Zinnia (nucleótido de GenBank AB003131), y DSA6 de lirio (nucleótido GenBank AF 082031).

Se ha demostrado que la actividad endonucleasa de CEL I es altamente especifica para emparejamientos erróneos por sustitución de bases y para emparejamientos erróneos resultantes de sucesos de inserción/deleción y que es independiente del contexto de la secuencia flanqueante. Por tanto esta es útil como un reactivo de detección de mutaciones en diversos métodos que implican selección mutacional. El sistema de detección de emparejamiento erróneo de CEL I es un ensayo sencillo que requiere amplificación de la secuencia diana por PCR, desnaturalización e hibridación para permitir la formación de heteroduplex entre el alelo de tipo silvestre y el alelo mutante, escisión enzimática del emparejamiento erróneo y análisis del producto por electroforesis en gel. Esto es ventajoso sobre otros sistemas de detección de emparejamiento erróneo conocidos, como HPLC desnaturalizante, debido a su especificidad y sensibilidad para la detección de emparejamientos erróneos en grandes tramos de ADN.

A modo de ejemplo, OLEYKOWSKI et al y YANG et al (en publicaciones citadas anteriormente) indican su uso para detectar modificaciones de secuencias en el gen BRCA 1 humano y SOKUENKO et al (Nucl. Acids Res., 29 e111, 2001) describen su uso para detectar mutaciones y polimorfismos en grandes regiones de ADN genómico. CEL I también se usa para selección de alto rendimiento en TILLNG (Selección de lesiones inducidas localmente en genomas), en la que después de la mutagénesis química se realiza la selección para mutaciones puntuales, o para la detección de polimorfismos en poblaciones naturales, denominado también “Ecotilling” (COMAI et al, Plant Journal, 37, 778-786, 2004). Esto se ha usado en plantas (COLBERT et al., Plant Physiology 126, 480-484, 2001; TILL et al., Genome Research 13, 524-530, 2003; PERRY et al., Plant Phsysiology 131, 866-871, 2003) así como en animales tales como el pez cebra (WIENHOLDS et al., Genome res., 13, 2700-2707, 2003). Las solicitud PCT WO 03/066809 propone el uso de CEL I en un método para reclasificar variaciones de secuencia entre polinucleótidos relacionados denominado “Reclasificación Genética por Resolución de Emparejamiento erróneo” (GRAMMR).

Sin embargo CEL I tiene la desventaja de tener una eficacia de escisión que varia de un emparejamiento erróneo a otro: en el caso de un bucle de ADN con una sola inserción de nucleótidos, OLEYKOWSKI et al. (Nucleic Acids Res. 1998 Oct 15; 26 (20): 4567-602) indican que la preferencia de substrato de CEL I es G>A>C>T; en el caso de emparejamientos erróneos por sustituciones de bases la preferencia de substrato de CEL I es C/C ≥ C/A ~C/T ≥G/G >A/C ~A/A ~T/C > T/G ~G/T ~G/A ~A/G > T/T. Esta eficacia es significativa en los emparejamientos erróneos C/A, C/C, C/T, G/G. Se observa una disminución de la actividad para los otros y es casi ineficaz en el emparejamiento erróneo T/T. Esta variación en la eficacia de escisión puede dar como resultado una menor precisión en la detección de algunas mutaciones cuando se necesita la detección de un alelo en un grupo de ADN.

Otro inconveniente limitante del uso de CEL I es el bajo rendimiento de los métodos de purificación disponibles. OLEYKOWSKI et al., comenzando con 7 Kg. de tallo de apio que contenía aproximadamente 350 g de proteína obtuvieron 3 ml de CEL I a 0,1 µg/µl; el procedimiento de purificación descrito por YANG et al. y en el documento PCT WO 01/62974 se obtuvieron 5µg de CEL I purificada con una actividad específica de 3,1 x 107 de proteína CEL I unidades/mg comenzando a partir de 105 Kg. de tallo de apio.

Para obtener grandes cantidades de CEL I, se ha propuesto producirla por tecnología de ADN recombinante. La solicitud PCT WO 03/066809 propone una amplia lista de vectores y células hospedadoras posiblemente adecuados que incluyen casi cualquiera de los sistemas de expresión procariotas o eucariotas conocidos; sin embargo, el único sistema de expresión realmente descrito en este documento es un vector basado en tobamovirus. La construcción resultante de la clonación en dicho vector del ADNc de CEL I fusionado a una secuencia que codifica una etiqueta de 6-Histidinas se ha usado para infectar plantas de tabaco. CEL I recombinante se recuperó del líquido intracelular de las plantas infectadas y se purificó por cromatografía de afinidad de metales sobre resina de NTA-níquel. El documento PCT WO 03/066809 no dice nada acerca del rendimiento de la enzima purificada. Esto indica que su actividad en una reacción GRAMMR es similar a la de la enzima natural purificada a partir del apio. Uno de los inconvenientes de este sistema es que... [Seguir leyendo]

1. Un método para producir una endonucleasa recombinante especifica de emparejamientos erróneos en el que dicho método comprende:

- expresar dicha endonucleasa recombinante en células de una planta hospedadora completa o de un órgano separado de esta, transformada transitoriamente por agroinfiltración con una cepa de Agrobacterium que contiene un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica dicha endonucleasa;

- aislar dicha endonucleasa recombinante de dichas células de la planta hospedadora.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha agroinfiltración se realiza en una hoja de dicha planta hospedadora.

3. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que dicha planta hospedadora pertenece al género Nicotiana.

4. Un método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha endonucleasa se aísla del órgano de la planta agroinfiltrada por un proceso que comprende las siguientes etapas:

- extraer el contenido de las células procedentes del órgano agroinfiltrado que expresa dicha endonucleasa; -añadir a dicho extracto sulfato de amonio a una concentración final de al menos 30% y separar el precipitado proteico del sobrenadante;

- añadir a dicho sobrenadante sulfato de amonio a una concentración final de al menos 80% y recuperar el precipitado proteico que contiene la endonucleasa.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el sulfato de amonio se añade a una concentración final de 30% en la primera etapa de precipitación y a una concentración final de 80% en la segunda etapa de precipitación.

6. Una preparación de endonucleasa recombinante especifica de emparejamientos erróneos que puede obtenerse por el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha endonucleasa se selecciona entre CEL I de Apium gravoeolens y BFN1 de Arabidopsis thaliana de SEC ID Nº: 2.

7. Una preparación de endonucleasa CEL I recombinante de la reivindicación 6, en la que dicha endonucleasa CEL I recombinante tiene la siguiente preferencia de emparejamientos erróneos: T/T ∼ T/G ∼ A/G ∼ G/G ∼ G/A ∼ G/T ≥ A/A ∼ C/C ≥T/C ∼ C/T > A/C ∼ C/A y puede reconocer un alelo mutante en presencia de 23 veces más el alelo de tipo silvestre.

8. Una preparación de endonucleasa BFN 1 recombinante de la reivindicación 6, que la que dicha endonucleasa BFN 1 recombinante tiene la siguiente preferencia de emparejamientos erróneos: G/G ∼ G/A ∼ A/G ∼ G/T ∼ T/G > T/T ∼ A/A ∼ C/C ∼ T/C > C/T ∼ A/C ∼ C/A, y puede reconocer un alelo mutante en presencia de 59 veces más el alelo de tipo silvestre.

9. El uso de una preparación de endonucleasa recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, para detectar en un dúplex de ADN, un emparejamiento erróneo resultante de una sustitución de bases o de inserción o deleción de uno o más nucleótidos en una cadena de dicho duplex.

10. El uso de una preparación de endonucleasa recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en un protocolo de escisión de emparejamiento erróneo por detección de lesiones inducidas localmente en los genomas (TILLING).

11. El uso de una preparación de endonucleasa recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, para la identificación de polimorfismos de ADN en poblaciones naturales, por Ecotilling.

12. El uso de una preparación de endonucleasa recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, como un reactivo de detección de emparejamientos erróneos.

13. El uso de una preparación de endonucleasa recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en un método de selección de emparejamientos erróneos.

14. El uso de una preparación de endonucleasa recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, para seleccionar de manera simultánea una o más mutaciones en un gen diana en una población de cualquier organismo o de una línea celular derivada del mismo realizando las etapas de:

a) amplificar dicho gen diana o parte del mismo para cada individuo de dicha población, b) clasificar dichos productos de amplificación en una matriz bi o tridimensional, que comprende líneas, filas (matriz bidimensional) y columnas (matriz tridimensional), c) reagrupar dichos productos de amplificación, para obtener diferentes grupos, representando cada grupo una fila, una línea o una columna de dicha matriz, d) añadir a cada grupo un producto de amplificación de referencia obtenido de un gen no mutado e incubar dichos grupos en condiciones que permitan la formación de heteroduplex, e e) incubar cada grupo con dicha preparación de endonucleasa, y f) detectar la presencia de heteroduplex en dichos grupos incubados.

15. El uso de una preparación de endonucleasa recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, para seleccionar de manera simultánea una o más mutaciones en un gen diana en una población de cualquier organismo o de línea celular derivada del mismo, realizando las etapas de:

a) clasificar cada individuo de dicha población en una matriz bi- o tri- dimensional que comprende líneas, filas (matriz bidimensional) y columnas (matriz tridimensional), b) agrupar cada fila, línea y columna para obtener diferentes grupos, representando por lo tanto cada grupo una fila, línea o una columna de dicha matriz, c) añadir a cada grupo un producto génico de referencia obtenido de un gen no mutado, d) amplificar dicho gen diana o parte del mismo en cada grupo para conseguir grupos de productos amplificados, e) incubar dichos grupos de productos amplificados en condiciones que permitan la formación de heteroduplex, f) incubar dichos grupos de productos amplificados con dicha preparación de endonucleasa, y g) detectar la presencia de heteroduplex en dichos grupos incubados.