Línea de células huésped CHO transfectadas con un vector de expresión pMSG-MBL ilustrado en un mapa plasmídico de la fig.

1 que contiene un polinucleótido codificante de la lectina humana de unión a manosa (MBL humana)

Campo técnico

La presente invención se refiere al desarrollo de procedimientos mediante los cuales resulta posible la producción en masa de lectina de unión a manosa humana recombinante multimérica (rhMBL).

Antecedentes de la invención

La lectina de unión a manosa (denominada "MBL" en lo sucesivo) es una proteína sérica implicada en la inmunidad natural (inmunidad innata). El peso molecular de la MBL es de 32 kDa. MBL está compuesta de un dominio C-terminal de reconocimiento de carbohidratos (CRD), un dominio de colágeno y una región rica en cisteínas en el extremo aminoterminal. Tres moléculas de MBL forman un complejo mediante la formación de una triple hélice que utiliza dominios de colágeno, y posteriormente hasta 6 complejos pueden combinarse entre sí mediante enlaces disulfuro entre moléculas (s-s-) entre residuos cisteína en el extremo N-terminal, reusltando en la formación de una molécula multimérica de MBL que consta de hasta 18 moléculas de MBL.

La forma oligomérica de MBL puede formar un complejo con otras proteínas tales como las serina proteasas asociadas a MBL (MBSP-1, MASP-2 ó MASP-3) o las proteínas asociadas a MBL (Mapa 19). Aunque la estructura y función moleculares generales de la MBL implicadas en la activación del complemento son similares a las de C1q, que es el primer componente del sistema del complemento, al contrario que C1q, MBL activa el sistema del complemento mediante el corte de C4 y C2. Este proceso de activación del complemento denominado ruta de la lectina se produce mediante la activación de la serina proteasa asociada a MBL tras la unión de la MBL al microbio. La activación del sistema del complemento por parte de MBL es una de las funciones de la MBL en la defensa primaria frente a la infección microbiana, antes de que tengan lugar las respuestas inmunológicas adaptativas. La unión de la MBL al microorganismo a través de dominios de reconocimiento de carbohidratos (CRD), que reconocen patrones de glucosilación únicos de las proteínas superficiales de un microorganismo, es un requisito previo de la activación del complemento. La unión de la MBL al microorganismo activa los precursores asociados a la MBL de las serina proteasas MASP-1 y MASP-2, conduciendo al corte de C4 y C2 del sistema del complemento, generando C4b2a y C3b. Algunas de las proteínas generadas en la activación del complemento se unen directamente a la superficie del microorganismo a modo de opsonina, y la MBL también puede funcionar como opsonina, provocando que la fagocitosis de los microbios unidos a la MBL resulte más eficiente por parte de las células fagocíticas. Algunas proteínas del complemento activado lisan directamente los microorganismos invasores mediante la formación de un complejo atacante de membranas (MAC) y otros fragmentos proteicos del complemento producidos durante el proceso de activación estimulan la secreción de citoquinas, que causan inflamación.

Algunos informes anteriores han descrito la expresión del gen MBL en una diversidad de células, tales como células CHO, células de hepatoma HLF o células EBNA HEK293. En particular, el nivel de expresión en las células CHO era muy elevado, pero la MBL producida eran principalmente monmeros y dímeros (Katsuki Ohtani et al., J. Immunol. Methods 222:135-144, 1999). La producción de forma oligomérica de MBL en células HEK293 EBNA se ha conseguido, pero la productividad bruta es inferior a 1 µg/ml (T. Vorup-Jensen et al., International Immunopharmacology 1:677-687, 2001). La producción de forma oligomérica de MBL resulta críticamente importante debido a que los monómeros y dímeros consistentes de 3 subunidades y 6 subunidades, respectivamente, presentan actividades reducidas o nulas. También es una cuestión importante durante el desarrollo de un producto farmacéutico a partir de MBL la creación de una línea celular altamente productora, debido a que resulta necesaria en cantidades de muchos miligramos.

La MBL también podría desempeñar un papel importante en la inmunidad adaptativa. Las células implicadas en la fagocitosis, tales como los neutrófilos y los macrófagos, desempeñan un papel importante en la eliminación de los microorganismos foráneos invasores mediante fagocitosis. Además de lo anterior, el macrófago es una célula presentadora de antígenos (APC), que activa las células T, resultando en la inducción de una respuesta inmunológica adquirida. Por lo tanto, la MBL multimérica implicada en la activación del sistema del complemento y a modo de opsonina desempeña un papel importante no sólo en la defensa primaria como componente del sistema inmunológico innato sino también en la inducción de respuestas inmunológicas adquiridas.

La cantidad de MBL en el suero humano varía de individuo a individuo, estando comprendida entre 50 ng/ml y varios µg/ml en virtud de la variación genética del gen de la MBL. Por ejemplo, al producirse una mutación puntual en el codón 52, 54 ó 57 del exón 1 del gen MBL, las moléculas de MBL no forman formas oligoméricas, produciendo complejos más pequeños no funcionales consistentes de no más de 3 moléculas de MBL. Al producirse una mutación en las regiones promotoras del gen MBL, el nivel de expresión de MBL se reduce, resultando en una elevada variación del nivel

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sanguíneo de MBL entre los individuos afectados. En general, aquellos niños o pacientes con neutropenia que presentan un nivel de MBL inferior a determinado nivel presentan una inmunidad débil, convirtiéndose en altamente susceptibles a las infecciones microbianas (Sumiya M. et al., Lancet 337:1569-1570, 1991; Summerfield J.A. et al., Lancet 345:886, 1995; Garred P. et al., Lancet 346:941, 1995; Summerfield J. et al., Br. Med. J. 314:1229, 1997; Mullighan C.G. et al., Scand. J. Immunol. 51:111-122, 2000; Neth O. et al., Lancet 358:614-618, 2001; Peterslund N.A. et al., Lancet 358:637638, 2001; Mullighan C.G. et al., Blood 99:3524-3529, 2002).

Según un estudio sobre pacientes crónicos de infección por virus de la hepatitis B, el nivel de MBL en la sangre es un factor crítico en el pronóstico de la enfermedad (Hakozaki Y. et al., Liver 22:29-34, 2002). En particular, entre los pacientes que desarrollaron insuficiencia hepática fulminante debida a la infección crónica por virus de la hepatitis B, la mortalidad de aquellos que presentaban un nivel sanguíneo de MBL superior a 3 µg/ml era de 0%, mientras que aquellos que presentaban un nivel sanguíneo de MBL de 1,5 µg/ml e inferior a 0,5 µg/ml era de 58% y más de 80%, respectivamente. Este estudio demuestra la clara relación entre el nivel sanguíneo de MBL y la mortalidad de los pacientes con una enfermedad infecciosa. Este estudio también sugiere que la suplementación de MBL en pacientes con un nivel reducido o nulo de MBL resulta beneficiosa.

Para que pueda utilizarse la MBL recombinante como agente terapéutico, la proteína MBL recombinante debe producirse en una cantidad masiva a un precio razonable en forma de moléculas oligoméricas activas. Al contrario que las citoquinas, resulta necesaria en una cantidad de muchos miligramos en cada paciente en cada aplicación. Por ejemplo, el volumen sanguíneo humano de media es aproximadamente 5 litros, requiriendo 25 mg para producir 5 µg/ml de MBL. Considerando el volumen de los demás líquidos corporales, podría requerir una cantidad mucho mayor en cada aplicación. Por lo tanto, ha sido una cuestión críticamente importante en el desarrollo del producto comercial a partir de la MBL, el establecimiento de no sólo una línea celular recombinante altamente productiva, sino también de una línea celular que produzca formas activas de MBL polimérica. Hocker B.A. et al., Faseb Journal 15(5):A1012, 2001, describen la expresión y caracterización de MBL recombinante humana que conserva su estructura oligomérica de orden elevado.

De esta manera, los presentes inventores han realizado todos los esfuerzos para establecer una línea celular recombinante que pueda producir MBL en una cantidad comercial y que simultáneamente pueda producir una forma oligomérica funcional de MBL, que sea capaz de activar el sistema del complemento mediante la unión específica a glucoproteínas de unión a MBL en presencia de MASPs. Como resultado de este esfuerzo, los presentes inventores han completado la presente invención mediante la confirmación de que podía producirse rhMBL activa adecuada para la utilización terapéutica en cantidades masivas en forma de polímero multimérico en una línea celular CHO transfectada con un vector de clonación que contiene una secuencia polinucleótida... [Seguir leyendo]

1. Línea de células huésped CHO transfectadas con un vector de expresión pMSG-MBL ilustrado en un mapa plasmídico de la fig. 1 que contiene un polinucleótido codificante de la lectina humana de unión a manosa (MBL humana).

2. Línea de células huésped CHO según la reivindicación 1, en la que la línea celular es la línea MBL D1-3 de células CHO depositada en la Korean Collection for Type Culture bajo el nº de acceso KCTC 10472BP.

3. Método para la producción en masa de MBL humna recombinante multimérica (rhMBL), que comprende las etapas siguientes:

(1) preparación de las líneas de células huésped CHO transfectadas con un vector de expresión pMSG-MBL ilustrado en un mapa plasmídico de la fig. 1 que contiene la secuencia de la región codificante de la MBL humana,

(2) producción de rhMBL mediante la expresión de la secuencia de la región codificante de la MBL humana en dichas células huésped CHO y a partir del cultivo de dichas células, y

(3) purificación de la rhMBL preparada en la etapa (2).

4. Método según la reivindicación 3, en el que la línea de células huésped CHO es la línea MBL D1-3 de células huésped CHO depositada bajo el nº de acceso KCTC 10472BP.

5. Método según la reivindicación 3, en el que la etapa (2) se caracteriza por las etapas siguientes:

cultivo en suspensión de las células en un medio sin suero/sin proteínas, y subcultivo de aquellas células bien adaptadas al medio sin suero/sin proteínas para el escalado gradual de las mismas, resultando en la producción en masa de proteína rh-MBL en forma de polímero multimérico.

6. Método según la reivindicación 3, en el que la etapa (3) se caracteriza por las etapas siguientes:

(a) fraccionamiento de las muestras que contienen rhMBL multimérico mediante la utilización de cromatografía de intercambio aniónico,

(b) preparación de una columna mediante empaquetamiento de sustrato al que se conjuga pre-S de virus de la hepatitis B,

(c) unión de la rhMBL a pre-S del virus de la hepatitis B específicamente mediante la adición de una muestra que contiene rhMBL a la columna en presencia de iones calcio, tras el equilibrado de la columna, y

(d) elución de las rhMBLs mediante la adición de una solución tampón suplementada con EDTA o EGTA de la columna en la que se había unido la rhMBL.

7. Método según la reivindicación 3, en el que la rhMBL es capaz de activar el sistema del complemento mediante la unión específica a una glucoproteína presente sobre la superficie de los microorganismos, en presencia de serina proteasa asociada a MBL, seleccionando dicha glucoproteína de entre un grupo que consiste de proteína pre-S de cubierta vírica glucosilada, proteína bacteriana glucosilada, proteína fúngica glucosilada y glucoproteína sintética.