Método para la detección y/o cuantificación de esporos de clostridium tyrobutyricum mediante citometría de flujo.

La presente invención se encuadra dentro del sector del control de alimentos y en concreto, dentro del sector de los métodos de detección de microorganismos en alimentos basados en la utilización de técnicas inmunoquímicas. Más concretamente, la invención se basa en un método para la detección y/o cuantificación de esporos de Clostridium tyrobutyricum mediante la concentración de los esporos de una muestra láctea, la formación de complejos junto con anticuerpos policlonales específicos anti-esporo conjugados con un fluorocromo y la detección de dichos complejos mediante citometría de flujo

Método para la detección y/o cuantificación de esporos de Clostridium tyrobutyricum mediante citometría de flujo.

La presente invención se encuadra dentro del sector del control de alimentos y en concreto, dentro del sector de los métodos de detección de microorganismos en alimentos basados en la utilización de técnicas inmunoquímicas. Más concretamente, la invención se basa en un método para la detección y/o cuantificación de esporos de Clostridium tyrobutyricum mediante la concentración de los esporos de una muestra láctea, la formación de complejos junto con anticuerpos policlonales específicos anti-esporo conjugados con un fluorocromo y la detección de dichos complejos mediante citometría de flujo.

Estado de la técnica anterior

Clostridium tyrobutyricum es un bacilo Gram (+), anaerobio estricto, capaz de metabolizar el lactato como fuente de carbono. Sus condiciones óptimas de crecimiento son a una temperatura de 35ºC, a un pH de 5,8 y con bajos niveles de sal en los quesos, es termorresistente y bajo condiciones desfavorables, es capaz de esporular. La endospora es liberada cuando la célula vegetativa se degrada.

El hábitat principal de estas bacterias es el suelo, en estas condiciones, las bacterias contienen una endospora (esporo) que ingresa al tracto intestinal de la vaca por medio del alimento en el que crece la bacteria y esporula. Posteriormente los esporos, eliminados por los animales con las heces, contaminan el medio, de aquí pasan a la leche en el momento del ordeño y cuando ésta se utiliza para elaborar queso, y si las condiciones son favorables, pueden llegar a producir células de Clostridium tyrobutyricum vegetativas que producen cambios indeseables (hinchazón tardía) en la calidad organoléptica de los quesos debido a la fermentación butírica que tiene lugar.

La hinchazón tardía depende del número inicial de esporos de Clostridium tyrobutyricum presentes en la leche. Se ha establecido que el número de esporos necesarios en leche para causar hinchazón tardía en queso Suizo y variedades de queso Gouda es de 1 a 5 esporas/ml (Hull et al., (1992) Australian Journal of Dairy Technology 47: 91-94).

La fermentación butírica es un grave problema en la fabricación de quesos de pasta dura y semidura, que ocasiona pérdidas de millones de euros en el sector cada año. Dicho problema se manifiesta a lo largo de la maduración del queso y provoca un defecto conocido como la "hinchazón tardía". En España, una parte importante de la producción quesera se ve afectada potencialmente por este problema (Rilla et al., 2003. International Journal of Food Microbiology 85 (1): 23-33.; González et al., 2007. Food Control 18 (6): 716-722.; Anónimo (2007a). Resolución de 11 de Julio de 2007, del Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria. Boletín Oficial de España 208: 36181-36182). El principal agente responsable de la fermentación butírica es Clostridium tyrobutyricum (Bergère y Sivelä, 1990. Bulletin of the International Dairy Federation 251: 15-23), una bacteria Gram positiva, formadora de esporos, anaerobia estricta y no patógena para humanos y animales (Wiedmann et al., 2000. Encyclopedia of Food Microbiology. Robinson RK, Batt CA y Patel PD (Editores), Academic Press, London, pp: 451-458), que procede fundamentalmente de los ensilados. Los esporos de Clostridium tyrobutyricum contaminan la leche y permanecen en ella hasta que se utiliza para la elaboración del queso, dado que el tratamiento térmico de pasteurización que recibe la leche, previamente, es insuficiente para inactivar los esporos (Franciosa et al., 1999. Journal of Food Protection. 62: 867-871).

A lo largo de la maduración del queso se produce la germinación de los esporos, seguida de una multiplicación de las formas vegetativas, que metabolizan el lactato y liberan como productos de la fermentación, gas (H₂ y CO₂) y ácido butírico (Rosen et al., 1989. Milchwissenschaft. 44 (6): 355-357; Herlin y Christiansson, 1993. Milchwissenschaft. 48 (12): 686-690). Como consecuencia, se pueden producir también defectos organolépticos en el queso como mal olor y sabor, debidos a la presencia de ácido butírico (Bergère y Favreau, 1987. Sciences des Aliments. 7 (nº hors-serie VII): 89-98).

Los métodos actuales de análisis utilizados para la detección de esporos de Clostridium tyrobutyricum son de varios tipos, en el de tipo microbiológico se tardan 7 días en obtener un resultado, tiempo en el que la leche ha sido ya utilizada en la elaboración de queso. Para evitar la fermentación se añade lisozima de huevo a la leche destinada a la producción de quesos madurados, con carácter preventivo y de forma generalizada, pero éste es un producto enzimático de elevado coste.

Los métodos inmunoquímicos presentan un límite de detección de hasta 30 esporos/ml. Para llegar a detectar los esporos con estos límites de detección, se concentran éstos mediante técnicas como la filtración en membrana de 0,45 micrómetros (WO8806734 A1).

Existen otros métodos de detección de Clostridium tyrobutyricum que consisten en técnicas de amplificación por PCR de fragmentos de ADN de genes específicos como por ejemplo el gen de la flagelina (López-Enríquez et al., (2007) Applied and Environmental Microbiology 73(11): 3747-3751). La detección de esporos de Clostridium tyrobutyricum mediante esta técnica tiene límites de detección similares al propuesto en la presente invención pero supone diversas etapas complejas de extracción del ADN de los esporos puesto que es conocido que los esporos de las bacterias esporulantes tienen unas cubiertas que las hacen resistentes a numerosas condiciones adversas. Debido a la estructura de las cubiertas de los esporos, para extraer el contenido de ácidos nucleicos son necesarios tratamientos prolongados y complejos con detergentes y enzimas que digieran las cubiertas. Esta serie de pasos hacen de éste método de detección un método complejo que, en el caso de que los esporos hayan desarrollado cubiertas más resistentes de lo habitual, la no extracción de ADN de todos los esporos puede suponer una infravaloración en la detección.

Teniendo en cuenta que el agente causante del problema de hinchazón tardía es la forma esporulada, la eficacia del método descrito por López-Enríquez et al. (2007) depende, en primer lugar, de un tratamiento óptimo de las muestras para conseguir acceder al ADN pero, además, en segundo lugar, de la eficacia de la amplificación por PCR (dependiente de muchos factores incluyendo la presencia de inhibidores).

Explicación de la invención

La presente invención se basa en un método para la detección y/o cuantificación de esporos de Clostridium tyrobutyricum mediante la concentración de los esporos de una muestra láctea, la formación de complejos junto con anticuerpos policlonales específicos anti-esporo conjugados con un fluorocromo y la detección de dichos complejos mediante citometría de flujo.

Mediante este método se consigue un efecto sorprendente ya que se mejora considerablemente el límite de detección de otros métodos basados en técnicas de inmunodetección (en el mejor de los casos 30 esporos/ml). En la presente invención se obtiene un resultado inesperado al conseguirse un límite de detección de 5-10 esporos/ml de leche mediante etapas sencillas; la selección de las fracciones de la leche que contienen los esporos, el tratamiento de estas fracciones para evitar el enmascaramiento de los esporos, la concentración de los esporos y su detección mediante citometría de flujo tras formar los complejos esporos-anticuerpos-fluorocromo. Además, mediante el método descrito en la presente invención se consiguen límites de detección similares a los obtenidos con métodos más complejos y con mayor número de inconvenientes como es el caso de los métodos basados en técnicas de PCR citadas en el estado de la técnica. Es conocido que los esporos de las bacterias esporulantes tienen unas cubiertas que las hacen resistentes a numerosas condiciones adversas, lo que permite a estos microorganismos colonizar ambientes cuando las condiciones son favorables. Debido a la estructura de las cubiertas de los esporos, para extraer el contenido de ácidos nucleicos es necesario un tratamiento prolongado y complejo con detergentes y enzimas que digieran las cubiertas.

Teniendo...

1. Método de detección y/o cuantificación de esporos de Clostridium tyrobutyricum que comprende: