MÉTODO PARA DETERMINAR NT-PROBNP EQUINO.

Un método para determinar NT-proBNP equino, o fragmentos del mismo que comprenden al menos 8 aminoácidos de SEC ID Nº:

1, que comprende las etapas de: -proporcionar una muestra equina, -poner en contacto la muestra con al menos un anticuerpo que se une específicamente a NT-proBNP equino y -determinar la presencia y/o concentración del NT-proBNP equino o fragmentos del mismo existentes en la muestra

La presente invención se refiere a un método para determinar NT-proBNP equino o fragmentos.

El péptido natriurético auricular (ANP), péptido natriurético cerebral (BNP) y el péptido natriurético de tipo C (CNP) pertenecen a una familia de hormonas que pueden secretarse desde la aurícula del corazón, los ventrículos del corazón y las células endoteliales vasculares.

En C-terminal, todos los péptidos natriuréticos tienen la misma estructura de anillo de 17 aminoácidos conectada por un enlace disulfuro. Esta parte es responsable de su actividad biológica. En la actualidad, se han caracterizado 3 receptores, el receptor ANP-A (específico de ANP y BNP), el receptor ANP-B (específico de CNP y ANP) y el receptor de eliminación. BNP se ha aislado por primera vez de cerebro porcino y se ha encontrado también después en el corazón porcino. Ya se ha descrito en la bibliografía que los péptidos natriuréticos protegen al organismo frente a un exceso de líquido y alta presión arterial. El papel biológico, bioquímico y patofisiológico de los péptidos natriuréticos ya se ha descrito exhaustivamente en publicaciones de revisión. En la actualidad, el valor de los péptidos natriuréticos como un marcador de suero para diagnóstico y control de la terapia de enfermedades cardiacas en seres humanos está bien documentado.

En seres humanos, la forma madura del BNP que se secreta principalmente del ventrículo se forma a partir de una preetapa molecular alta, la proBNP (1-108). El péptido C terminal fisiológicamente activo, proBNP (77-108), también denominado BNP-32, consiste en 32 aminoácidos, la forma N terminal que circula en plasma consiste en 76 aminoácidos (NT-proBNP (1-76)). Además, también se han descrito los fragmentos 8-29 y 31-57 de pre-proBNP, en los que particularmente la determinación del fragmento 8-29 para medir el 1-76 de NT-proBNP proporciona datos clínicos análogos.

Las enfermedades cardiacas desempeñan un papel importante no solamente en seres humanos, también los animales, especialmente mascotas, tales como perros y gatos, o animales útiles, tales como caballos, están aquejados de estas enfermedades. Los caballos que padecen enfermedades cardiacas generalmente no están muy sanos, sudan rápidamente, su pulso aumenta, tienen disnea o tienen fiebre. Aproximadamente 0,3 % de todos los caballos tienen un defecto cardiaco congénito, sus arterias pueden transportar menos oxígeno que en el estado sano. En la mayoría de los casos, sin embargo, se desarrollan problemas cardiacos en el transcurso de la vida, aparecen con frecuencia arritmias cardiacas, pero son principalmente normales en el estado en reposo. Las arritmias cardiacas patológicas son un señal de un daño miocárdico que puede estar causado por falta de oxígeno o por infecciones. Las inflamaciones del miocardio se llaman miocarditis. Si la estructura química de las fibras del miocardio cambia, el corazón ya no será capaz de bombear de forma apropiada sangre y se habla de miocardosis. Las inflamaciones del endocardio se desencadenan por bacterias que alcanzan el corazón a través de la sangre, por ejemplo, mediante pezuñas o articulaciones inflamadas. En el caso de una hidropesía del pericardio, entra agua en el pericardio a través de las paredes de los vasos sanguíneos. Como norma, el no tratamiento de problemas cardiacos dará como resultado insuficiencia cardiaca. En casos leves, la circulación tendrá un efecto equilibrante, en casos graves, se espera fallo cardiaco. En caballos que padecen un defecto de válvula de la mitad derecha del corazón, la sangre retenida en los órganos conducirá a cirrosis del hígado. Las enfermedades cardiacas se diagnostican por los veterinarios por medio de auscultación, ultrasonidos o ECG. Inicialmente, el caballo no se someterá a ninguna tensión e idealmente, debería alojarse en un establo abierto o en una caballeriza externa de modo que el corazón recibirá una gran cantidad de oxígeno. La curación o tratamiento, respectivamente, de enfermedades cardiacas puede tomar un tiempo muy largo, una terapia tardará de 4 a 6 semanas en cualquier caso. Algunos caballos pueden curarse permanentemente, otros tendrán una recaída cuando se detenga la medicación. Sin embargo, incluso en el caso de cura, no puede volver a exigirse rendimiento máximo al caballo. Puesto que el corazón es capaz de inicialmente equilibrar las disfunciones trabajando más duro, una enfermedad tal permanecerá indetectada en la mayoría de los casos, con la consecuencia de que el estado del corazón se deteriorará debido al esfuerzo aumentado del corazón. Los síntomas resultantes de enfermedades cardiacas, tales como fatiga, insuficiencia circulatoria, cansancio en la mayoría de los casos serán reconocibles cuando el corazón del animal ya no sea capaz de compensar la debilidad. En un caso tal, la enfermedad cardiaca ya habrá progresado tanto que la curación completa apenas será posible. El diagnóstico de enfermedades cardiacas en caballos tan pronto como sea posible sería, por lo tanto, de gran importancia y podría obviar daños irreparables o incluso prevenir que los caballos usados en deportes se vieran impedidos irrevocablemente para participar en deportes que impliquen carreras y torneos.

Como norma los cambios crónicos en la válvula cardiaca y el miocardio no son curables, pero la progresión adicional de la enfermedad cardiaca puede ralentizarse por el uso de medicamentos. También por esta razón, un diagnóstico temprano de una enfermedad cardiaca en desarrollo es importante. Como rutina, se usan métodos principalmente físicos para este fin, tal como auscultación de los sonidos cardiacos, el registro de un electrocardiograma, examinaciones de rayos X y ultrasónicas. Estos métodos de examinación principalmente tienen la desventaja de que pueden llevarse a cabo solamente después de que sea directamente detectable un daño cardiaco ya visible o audible. Además, los métodos de examinación físicos requieren dispositivos adecuados y principalmente caros para realizar un diagnóstico apropiado.

En general, las enfermedades cardiacas del caballo son altamente similares a enfermedades análogas en seres humanos.

En muchas enfermedades cardiacas, tales como, por ejemplo, insuficiencia cardiaca, cardiomiopatía dilatada, cardiomiopatía hipertrófica, disfunción e hipertrofia ventricular izquierda, se libera BNP. Esta hormona provoca la secreción del líquido mediante los riñones y, por lo tanto, regula el sistema cardiovascular. Puesto que este péptido se produce en el corazón y se produce crecientemente si el corazón se estresa en exceso y se congestiona, la detección del nivel de BNP en sangre es un medio adecuado para evaluar la insuficiencia cardiaca.

BNP, también como otros péptidos natriuréticos, desempeña una parte importante en la regulación del equilibro de agua y la presión sanguínea. Si la pared cardiaca se estira, libera más BNP, dando como resultado una secreción de sodio y líquido mediante el riñón y en una dilatación de los vasos sanguíneos que, en suma, son capaces de reducir la presión sanguínea y el llenado del corazón. BNP se sintetiza por las células del músculo cardiaco como proBNP que, finalmente, se escinde en BNP y proBNP N-terminal. Amabas partes del BNP se secretan en la sangre y pueden detectarse en la misma.

Las enfermedades cardiacas en animales se tratan, entre otros, en las siguientes publicaciones relevantes: Bright JM y Cali JV, J Am Vet Med Assoc 2000,216: 1110-4; Guglielmini C, Vet Res Commun 2003, 27 Suppl 1:555; Boswood A et al., J Small Anim Pract 2003, 44: 104-8; Takemura N et al., J Vet Med Sci 2003, 65: 1265-7; MacDonald KA et al., J Vet Intern Med 2003, 17: 172-7; Greco DS et al., Can Vet J 2003, 44: 293-7; Monnet E et al., J Am Vet Med Assoc 1997, 211: 569-72; Hamlin RL et al., J Vet Intern Med 1996, 10: 85-7; Gaschen L et al., J Vet Intern Med 1999, 13: 346-56.

Ya se conoce una pluralidad de métodos en la técnica anterior por medio de los cuales puede detectarse proBNP humano, o los fragmentos del mismo, respectivamente, en el suero de un individuo. Los documentos EP 0 648 228 B1, WO 03/87819 y FR 2 843 396 pueden mencionarse aquí como ejemplos.

En el documento US 2004/0018577, se ha descrito un inmunoensayo que comprende al menos tres anticuerpos que son capaces de unirse a diferentes epítopos de un analito. Los analitos a detectar aquí se refieren particularmente a la detección de marcadores respecto a enfermedades cardiacas, en los que entre otros pueden detectarse también BNP y proBNP.

Biondo A. W. et al. (Vet. Pathol. 2003, 40(5):501-506) describe... [Seguir leyendo]

1. Un método para determinar NT-proBNP equino, o fragmentos del mismo que comprenden al menos 8 aminoácidos de SEC ID Nº: 1, que comprende las etapas de:

- proporcionar una muestra equina,

- poner en contacto la muestra con al menos un anticuerpo que se une específicamente a NT-proBNP equino y

- determinar la presencia y/o concentración del NT-proBNP equino o fragmentos del mismo existentes en la muestra.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que en la determinación de NT-proBNP equino o fragmentos del mismo que comprenden al menos 8 aminoácidos de SEC ID Nº: 1, el al menos una anticuerpo se une específicamente al menos a un epítopo de NT-proBNP específico de SEC ID Nº: 1, en particular a un epítopo seleccionado de los epítopos con las secuencias PLGGLGPASEQS, PASEQSGIQELL, LLDRLGDSVLEP, SVLEPQAERMTL, PQAERMTLEPLQ, EPLQQDRGPAEA, LQQDRGPAEASE, DRGPAEASETRG, PAEASETRGAAP, RGAAPTGVLGPR, LGPRTKVLQALR, PRTKVLQALRGL o LQALRGLRSPKM.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado por que en la determinación de NT-proBNP equino o fragmentos del mismo que comprenden al menos 8 aminoácidos de SEC ID Nº: 1, se usa adicionalmente al menos un anticuerpo de NT-proBNP que no es específico de NT-proBNP equino.

4. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que en la determinación de NT-proBNP equino o fragmentos del mismo que comprenden al menos 8 aminoácidos de SEC ID Nº: 1, se usa adicionalmente al menos un anticuerpo que es específico de pre-proBNP equino, en particular un anticuerpo que se une específicamente al menos a un epítopo de SEC ID Nº: 1, seleccionado de los epítopos con las secuencias SPKMMRNSGCFG o DRIGSFSGLGCN.

5. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que el al menos un anticuerpo es policlonal y/o monoclonal.

6. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que la determinación de NT-proBNP equino o fragmentos del mismo que comprenden al menos 8 aminoácidos de SEC ID Nº: 1, se lleva a cabo por un método seleccionado del grupo que consiste en radioinmunoensayo, ensayo de inmunounión, transferencia de Western, inmunohistoquímica, inmunoensayo enzimático, dispositivo de flujo lateral (LFD, tiras de ensayo) y combinaciones de los mismos.

7. Un anticuerpo o una mezcla de anticuerpos caracterizado por que se une específicamente a NT-proBNP equino.

8. El anticuerpo o mezcla de anticuerpos de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizado por que se une al menos a un epítopo de SEC ID Nº: 1, seleccionado de los epítopos con las secuencias PLGGLGPASEQS, PASEQSGIQELL, LLDRLGDS-VLEP, SVLEPQAERMTL, PQAERMTLEPLQ, EPLQQDRGPAEA, LQQDRGPAEASE, DRGPAEASETRG, PAEA-SETRGAAP, RGAAPTGVLGPR, LGPRTKVLQALR, PRTKVLQALRGL, LQALRGLRSPKM, SPKMMRNSGCFG o DRIGSFSGLGCN.

9. Polipéptido con la secuencia de aminoácidos SEC ID. Nº: 1 o fragmentos del mismo con los aminoácidos 8 a 113, 8 a 81 y 82 a 113 de SEC ID Nº: 1.

10. Secuencia de aminoácidos seleccionada de las secuencias PLGGLGPASEQS, PASEQSGIQELL,

11. El uso de un anticuerpo o una mezcla de anticuerpos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8 para determinar NT-proBNP equino o fragmentos del mismo en un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

12. El uso de un péptido de acuerdo con la reivindicación 9 ó 10 para producir un anticuerpo o una mezcla de anticuerpos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8.

13. Un kit para determinar NT-proBNP equino o fragmentos del mismo que comprenden al menos 8 aminoácidos de SEC ID Nº: 1, que comprende al menos un anticuerpo o al menos una mezcla de anticuerpos de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, medios para la detección cualitativa y/o cuantitativa de una unión del al menos un anticuerpo o de la al menos una mezcla de anticuerpos con NT-proBNP equino o con los fragmentos del mismo y opcionalmente péptidos de acuerdo con la reivindicación 9 ó 10 como un control positivo o un patrón para una determinación de concentración.

14. El kit de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado por que el medio para la detección cualitativa y/o cuantitativa de una unión del al menos un anticuerpo o de la al menos una mezcla de anticuerpos con proBNP equino o con los fragmentos del mismo comprende al menos un anticuerpo adicional. LLDRLGDSVLEP, SVLEPQAERMTL, PQAERMTLEPLQ, EPLQQDRGPAEA, LQQDRGPAEASE, DRGPAEASETRG, PAEASETR-GAAP, RGAAPTGVLGPR, LGPRTKVLQALR, PRTKVLQALRGL, LQALRGLRSPKM, SPKMMRNSGCFG o DRIGSFSGLGCN.

15. El kit de acuerdo con la reivindicación 13 ó 14, caracterizado por que el al menos un anticuerpo y/o el al menos un anticuerpo adicional están marcados.

16. El uso de un kit de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15 en un método de acuerdo con 10 una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

17. El uso in vitro de un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 7 u 8 para diagnosticar enfermedades cardiacas en un caballo.

18. El uso in vitro de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 9 ó 10 para diagnosticar enfermedades cardiacas en un caballo.