Método para producir una preproquimosina, proquimosina o quimosina no bovina,

incluyendo el método las fases de (i) aislar o construir una secuencia de ácidos nucleicos codificando la preproquimosina, proquimosina o quimosina, donde la secuencia codificante se deriva de una especie mamífera seleccionada del grupo que consiste en una especie Camelidae. (ii) construir un vector de expresión comprendiendo dicha secuencia codificante y, operativamente vinculadas al mismo, señales de expresión apropiadas permitiendo que la preproquimosina, proquimosina o quimosina se exprese en una célula huésped, (iii) transformar dicha célula huésped con el vector de expresión, (iv) cultivar la célula huésped transformada bajo condiciones donde se exprese la secuencia codificante, y (v) recoger la preproquimosina, proquimosina o quimosina

Método de producción de quimosina no bovina y uso de la misma.

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general al campo de la fabricación de queso. En particular, se proporcionan nuevos medios recombinantes para proporcionar enzimas de coagulación de leche de origen animal no bovino, es decir no Bos taurus. Específicamente, la invención pertenece a un proceso para proporcionar de forma recombinante preproquimosina, proquimosina y quimosina de origen no bovino incluyendo las enzimas que se derivan de camellos.

Antecedentes técnicos y Técnica anterior

La coagulación enzimática de enzimas de coagulación de leche-por-leche, tales como la quimosina y la pepsina, es uno de los procesos más importantes en la fabricación de quesos. La coagulación de leche enzimática es un proceso bifásico: una primera fase donde una enzima, quimosina o pepsina proteolítica ataca a la κ-caseína, dando como resultado un estado metaestable de la estructura micela de la caseína y una segunda fase, donde la leche coagula posteriormente y forma un coágulo.

Quimosina (EC 3.4.23.4) y pepsina (EC 3.4.23.1), las enzimas de coagulación de la leche del estómago mamífero, son proteasas aspárticas pertenecientes a una clase amplia de peptidasas (Kappeler, 1998). Las proteasas aspárticas se encuentran en eucariotas, retrovirus y algunos virus vegetales. Las proteasas aspárticas eucarióticas son monómeros de aproximadamente 35 kDa, los cuales se incorporan en un par de dominios dispuestos en tándem con un alto grado de similitud, es decir un 20% o mayor. La estructura secundaria global consiste casi en su totalidad de hojas plegadas y es baja en α-hélices. Cada dominio contiene un sitio activo centrado en un residuo aspartil catalítico con una secuencia consenso [hidrofóbica]-Asp-Thr-Gly-[Ser/Thr] la cual ayuda a mantener la conformación correcta de φ-bucles del sitio, y con múltiples residuos hidrofóbicos cerca del residuo aspártico. Los dos sitios catalíticos están dispuestos el uno en frente del otro en la estructura terciaria de proteínas correctamente plegadas. En la quimosina bovina, la distancia entre las cadenas laterales aspárticas es de aproximadamente 3,5 A. Los residuos están extensivamente enlazados con hidrógeno, concomitantemente con los residuos de treonina contiguos, a los residuos correspondientes del otro dominio o los átomos limítrofes del propio dominio, para estabilizar la posición correcta. La actividad óptima de una proteasa aspártica se consigue cuando uno de los residuos aspárticos se protona y el otro se carga negativamente. Los sitios activos de quimosina y otras proteasas aspárticas se introducen, con accesibilidad baja, en medio de una fisura, de aproximadamente 40 A de longitud, la cual separa los dos dominios, y la cual está cubierto por una lengüeta que, en quimosina bovina y de camello, se extiende de aproximadamente Leu73 a Ile85 en el dominio N-terminal.

Cuando se producen en las células de las mucosas gástricas, la quimosina y la pepsina ocurren como preproquimosina y prepepsinógeno enzimáticamente inactivos, respectivamente. Cuando se excreta quimosina, un fragmento peptídico N-terminal, el prefragmento (péptido señal) se divide para dar proquimosina incluyendo un profragmento. La proquimosina es una forma sustancialmente inactiva de la enzima que, no obstante, se vuelve activa bajo condiciones acídicas para la quimosina activa por eliminación autocatalítica del profragmento. Esta activación ocurre in vivo en el lumen gástrico bajo condiciones de pH apropiadas o in vitro bajo condiciones acídicas.

Las características funcionales y estructurales de la preproquimosina, la proquimosina y la quimosina bovinas, es decir Bos taurus, se han estudiado de forma extensa (Foltmann et al. 1977). La preparte de la molécula de preproquimosina bovina comprende 16 residuos aa y la proparte de la proquimosina correspondiente tiene una longitud de 42 residuos aa. Foltmann et al., 1997 ha mostrado que la quimosina bovina activa comprendiendo 323 aa es una mezcla de dos formas, A y B, las cuales son ambas activas, y los datos de secuenciación indican que la única diferencia entre estas dos formas es un residuo de aspartato en la posición 290 en la quimosina A y un residuo de glicina en esta posición de la quimosina B.

Mientras que la quimosina se produce de forma natural en especies mamíferas incluyendo especies de rumiantes tales como bovinos, caprinos, búfalos y ovinos; cerdos (Houen et al., 1996); la especie Camelidae; primates incluyendo seres humanos y simios; y ratas, la quimosina bovina y (en una extensión menor) la quimosina caprina son actualmente las únicas de estas especies de quimosina animal que están disponibles comercialmente para la industria lechera. La quimosina bovina, en particular la quimosina de ternero, está comercialmente disponible tanto como extractos de enzima de estómago (cuajos) comprendiendo la quimosina producida de manera natural y como quimosina producida recombinantemente la cual está expresada en células huéspedes bacterianas, de levadura o fúngicas (véase por ejemplo WO 95/29999, Ward et al. 1990).

Recientemente, se han realizado estudios sobre las características funcionales de la quimosina de cuajo extraído del estómago de Camelus dromedarius (Wangoh et al., 1993 Elagamy, 2000) y se ha descubierto que el tiempo de coagulación de la leche de camella se reduce significativamente cuando se usa cuajo de camello en vez de cuajo de ternero bovino. Fracciones de cuajos de camello y de ternero crudas, las cuales se aislaron por cromatografía de intercambio aniónico, se han evaluado para conocer sus capacidades respectivas para coagular leche de camello y leche de vaca y se descubrió que la actividad de coagulación principal del cuajo de ternero (es decir, un extracto conteniendo tanto quimosina como pepsina) reside en la fracción de pepsina, es decir la quimosina bovina es sustancialmente inactiva con respecto a coagular la leche de camella, mientras que la actividad de coagulación principal de los extractos del cuajo de camello en la leche de camella residió en una primera fracción que, en comparación con la quimosina de ternero, eluyó a una concentración de NaCl algo inferior. La enzima activa de esta fracción aún no se ha caracterizado, pero es presuntamente quimosina. También se ha demostrado que esta fracción de cuajo de camello tiene una actividad de coagulación en la leche de vaca similar a la de la quimosina bovina (Wangoh et al., 1993). Es evidente, por lo tanto, que la coagulación de la leche de camella más eficaz que se pudo conseguir a un nivel industrial fue con la quimosina de camello disponible comercialmente y es también concebible que la quimosina de camello es también altamente adecuada como enzima de la coagulación de leche de vaca.

WO 95/29999 divulga un proceso para recuperar quimosina y pepsina bovinas a partir de un extracto crudo de tejidos animales, véase la página 6, líneas 12-18. Todos los experimentos se llevan a cabo sobre tejido bovino.

Ward et al, 1990 divulga un método para la producción mejorada de quimosina bovina por expresión de la enzima como una proteína de fusión. El objetivo parece para ser mejorar el rendimiento de la enzima.

Wangoh et al. 1993 divulga que se puede extraer cuajo de camello de camel abomasum, y que el cuajo de camello es más eficaz para coagular leche de camello que el cuajo de ternero.

Elagamy 2000 divulga que el cuajo de camello originado de tejido de abomasum es un coagulante relativamente eficaz para la caseína de leche de camella. El objetivo del estudio fue producir información que pueda probarse como útil en la coagulación de leche de camella y la producción de queso.

Se ha determinado la estructura primaria de quimosina aislada a partir de mucosa gástrica de camellos (Kappeler, 1998). La forma madura y activa de la quimosina de camello es de 323 residuos aa de longitud y tiene un peso molecular de 35,6 kDa y un punto isoeléctrico a pH 4.71. Ésta muestra un 85,1% de identidad de secuencia de aa con la quimosina bovina.

Actualmente, la quimosina bovina se fabrica industrialmente usando tecnología de ADN recombinante, por ejemplo usando hongos filamentosos tales como de la especie Aspergillus (véase por ejemplo Ward, 1990), cepas de levadura, por ejemplo de la especie Klyuveromyces, o especies bacterianas, por ejemplo E. coli, como...

1. Método para producir una preproquimosina, proquimosina o quimosina no bovina, incluyendo el método las fases de

2. Método según la reivindicación 1 donde la secuencia codificante para la preproquimosina, proquimosina y quimosina se aísla o deriva a partir de Camelus dromedarius.

3. Método según la reivindicación 1 donde la secuencia de ácidos nucleicos codifica una proteína de fusión comprendiendo preproquimosina, proquimosina o quimosina.

4. Método según la reivindicación 3 donde la proteína de fusión comprende glucoamilasa o un fragmento de la misma.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-4 donde la preproquimosina, proquimosina o quimosina, o una proteína de fusión de la misma, se segrega sobre la membrana de la célula huésped.

6. Método según la reivindicación 1 donde el vector de expresión se deriva de pGAMpR como se describe en Ward et al., 1990 substituyendo la secuencia codificante del vector para la proquimosina bovina con una secuencia codificante para la preproquimosina, proquimosina o quimosina no bovina.

7. Método según la reivindicación 6 donde el vector de expresión es pGAMpR-C como se contiene en las cepas de Aspergillus niger var.awamori depositadas bajo los números de registro CBS 108915 y CBS 108916.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-7 donde la célula huésped transformada se selecciona del grupo que consiste en una célula bacteriana, una célula fúngica, una célula de levadura, una célula mamífera, una célula de insecto y una célula vegetal.

9. Método según la reivindicación 8 donde la célula huésped es Aspergillus niger var. awamori.

10. Método según la reivindicación 9 donde la célula huésped de Aspergillus niger var. awamori se selecciona del grupo que consiste en CBS 108915 y CBS 108916.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-10 donde el rendimiento de la actividad de coagulación de la leche de la preproquimosina, proquimosina o quimosina es al menos un 25% mayor al rendimiento de la actividad de coagulación de la leche de la preproquimosina, proquimosina o quimosina bovina obtenida al usar, bajo condiciones de producción idénticas, el mismo vector de expresión, pero con una secuencia codificante para la preproquimosina, proquimosina o quimosina bovina en vez de la secuencia codificante para la preproquimosina, proquimosina o quimosina no bovina.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-11 comprendiendo, como otra fase, que la preproquimosina, proquimosina o quimosina cosechada se somete a un tratamiento de deglicosilación.

13. Método según la reivindicación 1 donde la célula huésped es una célula expresando una enzima de deglicosilación.

14. Método según la reivindicación 13 donde la enzima de deglicosilación es endoH.

15. Constructo de ADN capaz de expresar preproquimosina, proquimosina o quimosina no bovina, comprendiendo dicho constructo un vector de expresión comprendiendo una secuencia de ácidos nucleicos comprendiendo un gen codificando la preproquimosina, proquimosina o quimosina, donde la secuencia codificante se deriva de una especie mamífera seleccionada del grupo que consiste en una especie Camelidae, y, operativamente vinculadas, señales de expresión apropiadas permitiendo expresar la preproquimosina, proquimosina o quimosina en una célula huésped.

16. Constructo de ADN según la reivindicación 15 donde el constructo comprende una secuencia codificando un péptido señal para la preproquimosina, proquimosina o quimosina.

17. Constructo de ADN según la reivindicación 15 donde la señal de expresión comprende un promotor originalmente no asociado a la secuencia codificante.

18. Constructo de ADN según la reivindicación 15 donde la secuencia codificante se deriva de Camelus dromedarius.

19. Constructo de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 15-18 donde la secuencia de ácidos nucleicos codifica una proteína de fusión comprendiendo la preproquimosina, proquimosina o quimosina.

20. Constructo de ADN según la reivindicación 19 donde la proteína de fusión comprende glucoamilasa o un fragmento de la misma.

21. Constructo de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 15-20 donde el vector de expresión se deriva de pGAMpR como se describe en Wart et al., 1990 substituyendo la secuencia codificante del vector para la proquimosina bovina con una secuencia codificante para la preproquimosina, proquimosina o quimosina no bovina.

22. Constructo de ADN según la reivindicación 21 donde el vector de expresión es pGAMpR-C como se contiene en las cepas de Aspergillus Niger var. awamori depositadas bajo los números de registro CBS 108915 y CBS 108816.

23. Constructo de ADN según la reivindicación 15 comprendiendo una secuencia codificando una enzima de deglicosilación.

24. Constructo de ADN según la reivindicación 23 donde la enzima de deglicosilación es endoH.

25. Constructo de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 15-24 donde la secuencia codificante es una secuencia codificante de origen natural.

26. Constructo de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 15-24 donde la secuencia codificante se deriva de una secuencia codificante de origen natural por una o más sustitución(es) de nucleótidos silenciosas.

27. Célula huésped transformada con el constructo de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 15-26.

28. Célula huésped según la reivindicación 27 la cual se selecciona del grupo que consiste en una célula bacteriana, una célula fúngica, una célula de levadura, una célula mamífera, una célula de insecto y una célula vegetal.

29. Célula huésped según la reivindicación 28 la cual es de Aspergillus niger var. awamori.

30. Célula huésped según la reivindicación 29 donde la célula huésped de Aspergillus niger var. awamori se selecciona del grupo que consiste en las cepas depositadas como CBS 108915 y CBS 108916.

31. Composición comprendiendo una preproquimosina, proquimosina o quimosina no bovina producida por el método de cualquiera de las reivindicaciones 1-14.

32. Composición según la reivindicación 31 donde la preproquimosina, proquimosina o quimosina está en una forma sustancialmente deglicosilada.

33. Composición según la reivindicación 31 ó 32 comprendiendo preproquimosina, proquimosina o quimosina derivada del grupo que consiste en una especie Camelidae.

34. Método de fabricación de queso, comprendiendo añadir una cantidad eficaz de coagulación de leche de la composición según la reivindicación de cualquiera de las reivindicaciones 31-33 a leche y realizando otras fases de fabricación de queso apropiadas.

35. Método según la reivindicación 34 donde la leche se selecciona del grupo que consiste en leche de vaca, leche de camella, leche de búfala, leche de cabra, leche de oveja y una mezcla de cualquiera de estos tipos de leche.

36. Método según la reivindicación 34 donde el rendimiento del queso obtenido es superior al rendimiento obtenido bajo condiciones de fabricación idénticas usando la misma cantidad de preproquimosina, proquimosina o quimosina bovina.

37. Método de fabricación de queso, comprendiendo añadir una cantidad eficaz de coagulación de leche de una proquimosina o quimosina no bovina a la leche y realizar otras fases de fabricación de queso apropiadas, teniendo la proquimosina o quimosina no bovina en dicha leche una proporción C/P en el rango de 2-20, donde la proquimosina o quimosina no bovina se produce recombinantemente usando una secuencia codificante derivada de una especie mamífera seleccionada del grupo que consiste en una especie Camelidae.

38. Método según la reivindicación 37 donde la leche es leche de vaca.

39. Método según la reivindicación 37 ó 38 donde la proquimosina o quimosina no bovina se deriva de Camelus dromedarius.

40. Composición para la coagulación de leche comprendiendo una enzima bovina de coagulación de leche seleccionada de proquimosina, quimosina y pepsina y una enzima de coagulación de leche no bovina seleccionada de proquimosina y quimosina, donde la enzima de coagulación de leche no bovina se produce recombinantemente usando una secuencia codificante derivada de una especie mamífera seleccionada del grupo que consiste en una especie Camelidae.

41. Composición según la reivindicación 40 donde la proporción de actividad de coagulación de leche entre las enzimas de coagulación de leche bovina y no bovina está en el rango de 1:99 a 99:1.

42. Composición según la reivindicación 40 ó 41 donde la enzima de coagulación de leche no bovina se deriva de Camelus dromedarius.

43. Método de fabricación de queso a partir de leche, comprendiendo añadir una cantidad eficaz de coagulación de leche de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 40-42 a la leche y realizar otras fases de fabricación de queso apropiadas.

44. Método según la reivindicación 43 donde la leche es leche de vaca.