MÉTODO DE FABRICACIÓN DE TAGATOSA USANDO ISOMERIZACIÓN DE GALACTOSA DE ALTO RENDIMIENTO.

Un método de fabricación de tagatosa por isomerización de galactosa,

que incluye la etapa de añadir borato, caracterizado por que el borato se añade de 1 a 80 moles por 100 moles de galactosa

Campo Técnico

La presente invención se refiere a un método de fabricación de tagatosa usando isomerización de galactosa de alto rendimiento, más particularmente a un método para potenciar la velocidad de conversión de isomerización drásticamente, añadiendo 1-80 moles de borato, que se unen 5 específicamente a tagatosa, la cetosa, en la solución de reacción con respecto a 100 moles de galactosa en las condiciones óptimas, y a un método de fabricación de tagatosa con alto rendimiento usando la misma.

Técnica Anterior

Hasta la fecha, la tagatosa se ha preparado a partir de galactosa por síntesis química. De 10 acuerdo con el método convencional de síntesis química, la galactosa se isomeriza en presencia de una sal inorgánica, mediada por hidróxido metálico como catalizador, para formar el intermedio del complejo de hidróxido metálico-tagatosa. El intermedio se neutraliza con ácido para producir tagatosa. Sin embargo, este método convencional de síntesis química es muy complicado en su proceso, e ineficaz, y genera residuos industriales, incluso aunque fuera económico y diera el producto con alto rendimiento. 15

Otro método para producir tagatosa es una conversión mediada por enzimas, en la que aldosa o derivados de aldosa se convierten en cetosa o derivados de cetosa, seguido de la conversión de galactosa en tagatosa usando la enzima. Se sabe que la arabinosa isomerasa que se ha usado para la conversión de L-arabinosa en L-ribulosa puede generar tagatosa usando galactosa como un sustrato in vitro. Por consiguiente, se han presentado muchas arabinosas isomerasas que tienen diferentes orígenes 20 y métodos de fabricación de tagatosa a partir de galactosa usando la misma.

Los métodos para la fabricación de tagatosa se describen adicionalmente en los documentos US 4.273.922, WO 2005/047510, and Yoon et. al., World J. of Microbiology and Biotechnology, Vol. 19, 2003, páginas 47-51.

La isomerización de galactosa a tagatosa es una clase de reacción reversible, que sugiere que la 25 concentración del reactante se equilibra con la concentración del producto. Esta reacción enzimática se caracteriza por que la velocidad de conversión aumenta relativamente en proporción a la temperatura de reacción termodinámicamente. Por lo tanto, el desarrollo de una nueva enzima estable a alta temperatura y el proceso de isomerización usando la misma son factores clave para la conversión mediada por encima usando isomerasa para producir tagatosa. 30

La arabinosa isomerasa convencional originada a partir de E. coli presentaba una velocidad de conversión de tagatosa muy baja a partir de galactosa, que era del 25%, cuando la isomerización se realizaba a 30ºC durante 24 horas. La arabinosa isomerasa originada a partir del microorganismo termófilo Geobacillus stearothermophilus presentaba un 46% de velocidad de conversión a 60ºC, que es una condición de reacción estable de la que se ha informado. Cuando se usó arabinosa isomerasa 35 hipertermófila originada a partir de Thermotoga maritima para la reacción de isomerización a 70ºC y 80ºC, la velocidad de conversión a partir de galactosa a tagatosa era del 50% y 56%, respectivamente (Oh, D.K., Kim, H.J., Ryu, S.A., Kim, P., 2001. Development of an immobilization method of l-arabinose isomerase for industrial production of tagatose. Biotechnol. Lett 23, 1859-1862.; Kim, H. J., Oh, D.K., 2005. Purification and charecterization o fan L-arabinose isomerase from an isolated strain of Geobacillus 40 thermodenitrificans producing d-tagatose, J. Biotech. Nov 4; 120 (2):162-73. Epub 2005 Aug 9.; Lee, D.W., Jang, H.J., Choe, E.A., Kim, B.C., Lee, S.J., Kim, S.B., Hong, Y.H., Pyun, Y.R., 2004. Characterization of a thermostable l-arabinose (d-galactose) isomerase from the hyperthermophilic eubacterium Thermotoga maritima. Appl. Environ. Microbiol. 70, 1397-1404.).

La aplicación de la enzima termófila y la reacción a alta temperatura pueden aumentar la 45 velocidad de conversión de galactosa a tagatosa gradualmente. Sin embargo, en general, el pardeamiento de la solución de azúcar a la temperatura de reacción de 70ºC, o mayor, aumenta drásticamente en proporción al aumento de temperatura. Además, los subproductos generados por dicha reacción a alta temperatura tienen una mala influencia sobre la pureza del producto final y los costes de purificación. Por lo tanto, el aumento de la temperatura de reacción está limitado. De esta manera, la mejor temperatura de 50 reacción aplicable parece ser 70ºC y la máxima velocidad de conversión de isomerización a esa temperatura es del 56%. Hasta ahora, no se ha obtenido una velocidad de conversión mayor.

Descripción de la invención

De esta manera, los presentes inventores completaron esta invención confirmando que el método de fabricación de tagatosa usando isomerización de galactosa que incluye la etapa de añadir borato, que se une específicamente a la tagatosa, da un mayor rendimiento que el método convencional.

Un objeto de la presente invención es proporcionar un método de fabricación de tagatosa, 5 mediante isomerización de galactosa, usando una isomerasa termófila y células hospedadoras que la contienen, más particularmente un método para potenciar la velocidad de conversión de la isomerización añadiendo borato que se une específicamente a tagatosa, y un método de fabricación de tagatosa con alto rendimiento usando la misma.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar un método para potenciar artificialmente la 10 velocidad de conversión de isomerización, añadiendo una cantidad apropiada de borato y realizando la isomerización a alta temperatura en condiciones que inducen la unión selectiva del borato a tagatosa.

Para conseguir los objetos anteriores, los presentes inventores aumentaron la velocidad de conversión drásticamente añadiendo borato, que se une específicamente a tagatosa, para producir tagatosa a partir de galactosa usando arabinosa isomerasa originada de microorganismos termófilos o 15 hipertermófilos, y se confirmó adicionalmente que la tagatosa podía producirse eficazmente a partir de galactosa usando el método con alto rendimiento.

La presente invención se describe en detalle en lo sucesivo en este documento.

La arabinosa isomerasa de este documento puede originarse a partir de diversos microorganismos termófilos, incluyendo microorganismos Geobacillus sp., Thermotoga sp., Thermus sp., 20 etc., aunque no siempre están limitados a éstos. Las arabinosas isomerasas originadas a partir de diferentes cepas pueden aplicarse en diferentes condiciones de reacción, siempre y cuando las condiciones estén dentro de sus condiciones de reacción óptimas propias (temperatura, pH). De esta manera, cada isomerización realizada en dicha condiciones se incluye en los criterios de la invención.

La sal que es capaz de unirse específicamente a la tagatosa en este documento es borato. El 25 borato usado en la presente invención se unió a tagatosa bastante más específicamente que a galactosa (Figura 1). La adición de borato induce la isomerización de galactosa mucho más eficaz que el método convencional sin usar borato y, como resultado, se transfiere el equilibrio de fases entre el sustrato y el reactivo.

El efecto de una sal de la invención no está limitado a borato y puede usarse cualquier otra sal 30 que se una específicamente a tagatosa, es decir, el efecto de la invención puede provocarse por diferentes sales en las diferentes condiciones. Por lo tanto, todos los mecanismos de adición de una sal específica a tagatosa para aumentar la velocidad de conversión se incluyen en los criterios de la presente invención.

Breve Descripción de los Dibujos 35

La aplicación de las realizaciones preferidas de la presente invención se entiende mejor con referencia a los dibujos adjuntos, en los que:

La Figura 1 es un diagrama que ilustra los resultados de TLC (cromatografía en capa fina) realizada después de la reacción de galactosa y tagatosa con borato en las diversas condiciones.

Carril 1, tagatosa 40

Carril 2, galactosa

Carril 3, galactosa + borato

Carril 4, tagatosa + galactosa + borato

Carril 5, tagatosa + galactosa

La Figura 2 es un gráfico que ilustra la velocidad de conversión de galactosa a tagatosa 45 dependiente del pH, con y sin adición de borato, en el que la mayor velocidad...

1. Un método de fabricación de tagatosa por isomerización de galactosa, que incluye la etapa de añadir borato, caracterizado por que el borato se añade de 1 a 80 moles por 100 moles de galactosa.

2. El método de fabricación de tagatosa de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la isomerización se realiza en el intervalo de pH de 8,5 a 9.

3. El método de fabricación de tagatosa de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la 5 isomerización se realiza en el intervalo de temperatura de 60ºC a 70ºC.