Método de extracción y detección de antígenos de anisakis en alimentos destinados al consumo humano o animal.

La presente invención se refiere a un método de extracción y detección de alérgenos de parásitos de pescado en muestras alimentarias para el consumo humano o animal. La extracción se basa en aplicar soluciones con baja fuerza iónica, homogeneización, sonicación y diferentes pH a diversos tipos de pescado ya sean frescos o tratados. La detección se basa en métodos inmunoquímicos mediante el uso de anticuerpos policlonales que permiten detectar proteínas antigénicas del parásito así como anticuerpos policlonales que permiten detectar el alérgeno Ani s 4, que por sus características físico-químicas resiste el tratamiento térmico del alimento. El método es sensible, ya que se puede detectar Ani s 4 en cantidades inferiores a 1ppm con tasas de recuperación mayores a un 65%. El método descrito es específico ya que no muestra reactividad cruzada con componentes de las distintas matrices ensayadas

Método de extracción y detección de antígenos de Anisakis en alimentos destinados al consumo humano o animal.

La presente invención se refiere a un método de extracción y detección de alérgenos de parásitos de pescado en muestras alimentarias para el consumo humano o animal. La extracción se basa en aplicar soluciones con baja fuerza iónica, homogeneización, sonicación y diferentes pH a diversos tipos de pescado ya sean frescos o tratados. La detección se basa en métodos inmunoquímicos mediante el uso de anticuerpos policlonales que permiten detectar proteínas antigénicas del parásito así como anticuerpos policlonales que permiten detectar el alérgeno Ani s 4, que por sus características físico-químicas resiste el tratamiento térmico del alimento. El método es sensible, ya que se puede detectar Ani s 4 en cantidades inferiores a 1 ppm con tasas de recuperación mayores a un 65%. El método descrito es específico ya que no muestra reactividad cruzada con componentes de las distintas matrices ensayadas.

Estado de la técnica anterior

El género Anisakis incluye parásitos nemátodos que pertenecen a varias especies relacionadas. Mediante el uso de marcadores morfológicos y genéticos/moleculares actualmente se reconocen las siguientes especies de Anisakis: Anisakis pegreffii, Anisakis physeteris, Anisakis schupakovi, Anisakis simplex, Anisakis typical, Anisakis ziphidarum, Anisakis typica, Anisakis brevispicuiata o Anisakis paggiae.

Las especies de Anisakis alcanzan la madurez sexual en el estómago de cetáceos y, menos frecuentemente, en pinnipedos. Estos mamíferos pueden infestarse por ingestión de a) hospedadores paraténicos, es decir, peces (principalmente teleósteos) y cefalópodos (principalmente calamares), que albergan la tercera fase larvaria del parásito (L3), y b) por ingestión de krill, como intermedio, que también alberga las larvas L3 (por ejemplo, ballenas).

Al igual que los mamíferos marinos, los seres humanos también pueden infestarse por larvas L3 de Anisakis mediante la ingestión de peces y calamares crudos o poco cocinados portadores del parásito, lo cual produce una enfermedad clínica denominada anisakiosis o anisakiasis.

Cuando las larvas L3 de Anisakis infestan a seres humanos, a menudo causan síntomas gastrointestinales que pueden estar asociados con reacciones alérgicas de distinta gravedad. Dependiendo de la localización de las larvas y los síntomas dominantes, se han presentado cuatro formas clínicas principales de anisakiosis (gástrica/gastroalérgica, intestinal, extragastrointestinal y alérgica) en seres humanos. En la forma gástrica (aguda) de anisakiosis, la larva penetra la pared gástrica y frecuentemente se observa un curso clínico caracterizado por dolor epigástrico agudo, náuseas y vómitos unas pocas horas después de la ingestión de pescado que contenga larvas de Anisakis L3 vivas. Además, también pueden observarse síntomas alérgicos en individuos sensibilizados (aproximadamente el 10% de los casos).

La presencia de larvas de Anisakis en pescado produce en el consumidor la infestación por las larvas vivas cuando se consume el pescado crudo o sometido a tratamientos. La larva L3 de Anisakis es capaz de segregar proteínas que pueden producir reacciones alérgicas graves en individuos sensibilizados. Estas reacciones pueden ser producidas por la ingestión de las larvas vivas o muertas. Varios de los alérgenos de Anisakis descritos hasta la fecha son estables a congelación, altas temperaturas o altas presiones y resistentes a variaciones de pH y a la acción de enzimas digestivas. En su estructura poseen entre otros, grupos sulfidrilo (SH) que posibilitan la formación enlaces covalentes con proteínas de la matriz en la que se encuentran, lo que puede complicar su extracción y modificar su capacidad antigénica.

Existen diferentes técnicas de complejidad y eficacia variables para detectar la presencia de la larva de Anisakis en el músculo y vísceras de pescado. Se pueden enumerar las siguientes: Examen visual simple, transiluminación con luz ultravioleta, digestión, espectroscopia de imagen por absorción/reflexión, diferencia de conductividad (W093/14400). Todas ellas tienen como objetivo la detección del parásito vivo o muerto pero no detectan la presencia de antígenos del parásito en el músculo del pescado.

Por otra parte han sido descritas técnicas de detección basadas en secuencias nucleotídicas y peptídicas pertenecientes a las larvas de Anisakis pero que no están basadas en la extracción, concentración o captura de los antígenos de Anisakis a partir de muestras alimentarias (WO2008006927 A1).

El problema técnico que plantea la detección de antígenos alergénicos de larvas de Anisakis es la dificultad en la extracción de antígenos propios del parásito que sean válidos en un paso posterior para inducir la producción de anticuerpos contra dichos antígenos y/o para que sean detectados por anticuerpos ya generados con anterioridad.

Se han descrito métodos de extracción de antígenos que utilizan la incubación de larvas vivas a rangos de pH similares al del estómago de humanos (ES2209592 y Moneo et al. (2005) Parasitol. Res. 96(5):285-9). Para una detección precisa se requiere un proceso de extracción de antígenos que sea robusto, rápido, eficaz y sencillo que permita la detección de antígenos presentes en una muestra que contenga o haya contenido larvas de Anisakis vivas o muertas.

En el caso de parásitos de peces que suponen un riesgo para la salud, como las especies pertenecientes al género Anisakis, hay que añadir que las matrices varían de un pescado a otro, incluso tratándose de pescados frescos, y se pueden modificar al aplicar procesos de conservación y tratamiento tecnológico debido a la labilidad de las proteínas del pescado y a la rápida oxidación de sus lípidos. Por ello, es necesario disponer de un método de extracción sencillo, sin pasos complejos de captura y aislamiento de un alérgeno de interés en salud humana, que sea aplicable a diferentes pescados, ya sean frescos, congelados o cocinados y que permita la detección de antígenos alérgenos en concentraciones traza.

Explicación de la invención

La presente invención se refiere a un método de extracción y detección de alérgenos de parásitos de pescado en muestras alimentarias para el consumo humano o animal. El método permite la extracción sencilla y eficaz sin pasos de captura y aislamiento del alérgeno. Además se identifica la presencia de alérgenos de interés en salud humana. Mediante la aplicación de este método se extraen alérgenos de Anisakis en concentraciones inferiores a 1 ppm y con tasas de recuperación superiores a un 65%. El método es aplicable a diferentes pescados, a muestras procedentes de diferentes partes del pescado o a otras muestras que contienen cualquier procesado de pescado. La detección de los antígenos de Anisakis se lleva a cabo por medio de técnicas inmunoquímicas basadas en anticuerpos policlonales. Utilizando anticuerpos policlonales frente a un extracto crudo del Anisakis, se detectan diferentes proteínas del parásito permitiendo la identificación de antígenos incluso en los casos en que la inspección veterinaria no detecta al parásito. Asimismo al utilizar anticuerpos policlonales dirigidos al alérgeno Ani s 4, se puede detectar la presencia del alérgeno que, debido a sus propiedades físico-químicas de bajo peso molecular, termoestabilidad, resistencia a pepsina y a altas presiones resiste los procesados, tratamientos o los diferentes procesos culinarios. El método descrito es específico ya que no muestra reactividad cruzada con componentes de las distintas matrices ensayadas.

La extracción y posterior detección de algunos alérgenos en alimentos puede ser complicada ya que suelen estar en concentraciones traza y en matrices complejas. Además cuando se trata de alimentos ya elaborados, conservados o cocinados, la extracción y detección de los alérgenos puede verse alterada por el procesamiento del alimento. La detección por métodos inmunoquímicos basados en anticuerpos (ELISA, Western blot, dot blot o tiras inmunocromatográficas) permite la identificación específica del alérgeno en el extracto. Sin embargo, la alteración del alérgeno por el procesamiento del alimento puede alterar su extracción y/o detección. En la presente invención, esto se soluciona utilizando un método de extracción... [Seguir leyendo]

1. Método de extracción y detección de antígenos del género Anisakis en un alimento destinado al consumo humano y/o animal que comprende: