Un método para preparar un hapteno de fórmula I Hapteno I adecuado para el uso en la producción de un anticuerpo capaz de unirse a al menos un epítopo estructural de una fenetanolamina tal como,

pero no limitada a, ractopamina, isoxsuprina o ritodrina, comprendiendo el método la etapa de hacer reaccionar un derivado de fenetanolamina de la fórmula D, en la que Z1 es un reticulador, con un derivado de fenilalquilcarbonilo de la fórmula E, en la que Z2 es H; Y es independientemente H o CH3; W es independientemente H o CH3; n es independientemente 1 o 2; y m es independientemente 0 o 1

Haptenos derivados de fenetanolamina, inmunógenos y conjugados que los comprenden y anticuerpos que reconocen dichos inmunógenos y conjugados La presente invención se refiere a un método para preparar haptenos que son útiles para la preparación de inmunógenos, anticuerpos y conjugados, para el uso en inmunoensayos competitivos para la detección de fenetanolaminas tales como, pero no limitadas a, ractopamina, isoxsuprina y ritodrina.

La presente divulgación también se refiere a un método y un estuche para detectar o determinar fenetanolaminas tales como, pero no limitadas a, ractopamina, isoxsuprina y ritodrina.

Por "detectar" se entiende analizar cualitativamente la presencia o ausencia de una sustancia. Por "determinar" se entiende analizar cuantitativamente la cantidad de una sustancia.

La ractopamina es un agente fenetanolamínico mejorador de la flaqueza recientemente aprobado como un aditivo alimentario para cerdos en los Estados Unidos. Puercos a los que se administra ractopamina en la dieta muestran velocidades de crecimiento y eficacias de alimentación incrementadas y una deposición de grasas disminuida, con relación a los animales no tratados.

Los º-agonistas de fenetanolamina tienen una historia de uso con propósitos no autorizados por productores de ganado que esperan mejorar la economía de la producción ganadera. El uso inapropiado de º-agonistas puede provocar un riesgo grave para la salud humana debido a los residuos que dejan en la carne y otros productos alimenticios de origen animal. En efecto, en Europa, todos los º-agonistas están prohibidos para el uso en ganado y para mejorar el rendimiento atlético bajo la Directiva de la UE 96/22/EC.

La presencia de residuos de fármaco en tejidos animales es un problema para la seguridad alimentaria, especialmente cuando el compuesto se ha usado ilegalmente o de un modo proscrito por los funcionarios reguladores (uso no autorizado) . En un esfuerzo para combatir tal uso ilícito de compuestos º-agonistas, las organizaciones reguladoras en todo el mundo prueban tejidos animales y fluidos corporales con respecto a la presencia de tales fármacos ilícitos.

Se han usado ampliamente acciones de unión específicas, tales como interacciones anticuerpo-antígeno, en inmunoensayos para detectar una variedad de sustancias presentes en fluidos biológicos. Así, por ejemplo, podrían usarse radioinmunoensayos para la determinación de fenetanolaminas tales como ractopamina, isoxsuprina y ritodrina. Los radioinmunoensayos son muy sensibles pero no requieren trazadores radionucleotídicos. Los ensayos de inmunoabsorción con enzimas ligadas (ELISA) son una alternativa no radiactiva que podría usarse para la determinación cualitativa y cuantitativa de fenetanolaminas tales como, pero no limitadas a, ractopamina, isoxsuprina y ritodrina.

Haasnoot et ál. (The Analyst (1994) , 119, "Determination of fenoterol and ractopamine in urine by enzyme immunoassay", 2675-2680) divulgan un inmunoensayo enzimático urinario para ractopamina. El anticuerpo de Haasnoot se derivaba de un derivado de fenoterol y mostraba 20% de reactividad cruzada con ractopamina, pero el análisis de ractopamina no se correlacionaba bien con el análisis de GC-MS. Elliott et ál. (The Analyst (1998) , 123, "Screening and confirmator y determination of ractopamine residues in calves treated with growth promoting doses of the º-agonist", 1103-1107) divulgan un inmunoensayo para residuos de ractopamina. El anticuerpo de Elliott, cuando se usaba en un inmunoensayo en el que las muestras se hidrolizaban enzimáticamente antes del análisis, se correlacionaba bien con LC-MS-MS pero, como con Haasnoot et ál., los anticuerpos se producían de un modo no dirigido, contra un derivado de fentoterol.

Shelver y Smith (Journal of Immunoassay (2000) , 21 (1) , "Development of an immunoassay for the º-adrenergic agonist ractopamine", 1-23) divulgan la preparación de anticuerpos policlonales generados a partir de hemiglutarato de ractopamina-KLH. El hapteno se prepara mediante la reacción de ractopamina con anhídrido glutárico, seguido por conjugación con un material portador que confiere antigenicidad. El método empleado para sintetizar hemiglutarato de ractopamina es incontrolado y dará como resultado la derivación de ractopamina en una cualquiera de las posiciones 1, 10, 10' y N. El anticuerpo de Shelver y Smith generado muestra una sensibilidad (IC50) de 4, 2 ng/ml hacia ractopamina. El anticuerpo también exhibe 33% de reactividad cruzada con dobutamina.

Shelver et ál. (J. Agric. Food Chem. 48 (2000) , "Production and characterisation of a monoclonal antibody against the º-adrenergic agonist ractopamine", 4020-4026 y su Patente de EE. UU. Nº 6.274.334) divulgan la generación de un anticuerpo monoclonal, en el que se usó glutarato de ractopamina-hemocianina de lapa de ojo de cerradura como el antígeno para la generación de anticuerpo. El clon de anticuerpo seleccionado (5G10) muestra 5, 3% de reactividad cruzada con dobutamina y 3, 6% de reactividad cruzada con ritodrina.

Un anticuerpo policlonal se genera mediante inmunización repetida de un huésped mamífero no humano con el inmunógeno diana. El antisuero resultante se recoge y los anticuerpos se aíslan. Para generar un anticuerpo monoclonal, linfocitos procedentes de un animal inmunizado se fusionan con una línea celular de mieloma para producir células híbridas o hibridomas. Estos hibridomas pueden clonarse para la producción del anticuerpo monoclonal secretado. Un anticuerpo monoclonal reconocerá un solo epítopo, mientras que un antisuero policlonal puede reconocer varios epítopos en el mismo antígeno. De ahí que la tecnología de anticuerpos monoclonales pueda aplicarse habitualmente para generar un anticuerpo con más especificidad para el inmunógeno diana.

En la referencia de Shelver et ál. mencionada anteriormente, se ha usado un enfoque de ‘pistola de dispersión' para generar anticuerpos policlonales para ractopamina. El método incontrolado usado para preparar el hapteno de 10 ractopamina sugiere que el inmunógeno resultante está compuesto por una mezcla de ractopamina ligada a hemocianina de lapa de ojo de cerradura (KLH) en una cualquiera de las posiciones 1, 10, 10' y N. La inmunización con tal inmunógeno dará como resultado la generación de antisueros con una diversidad de especificidad. Esto se corrobora en los datos de reactividad cruzada presentados en la referencia de Shelver. Su anticuerpo policlonal reacciona cruzadamente 33% con dobutamina, mientras que su anticuerpo monoclonal reacciona cruzadamente 15 5, 3% con dobutamina. En contraste, la introducción dirigida de un grupo reticulador sobre un solo grupo hidroxilo fenólico del hapteno diana, de acuerdo con la presente invención, produce un efecto sorprendente (un reticulador heterofuncional, según se define en la presente memoria, es una estructura que incorpora uno o más grupos funcionales que contienen uno o más heteroátomos, que se liga, por ejemplo, a través de unión covalente, con un sustrato (en este caso un hapteno) , siendo además capaz el reticulador de ligarse a un péptido, un polipéptido o una 20 proteína o un agente marcador detectable) . Los anticuerpos generados para los presentes haptenos son altamente específicos y no reaccionan cruzadamente significativamente con dobutamina. En el caso de la ractopamina, el anticuerpo generado para el derivado en la posición 10 reacciona cruzadamente 0, 186% con dobutamina, mientras que el anticuerpo generado para el derivado en la posición 10' exhibe una reactividad cruzada de <0, 8% con dobutamina. La única explicación para la reactividad cruzada de los anticuerpos de Shelver con dobutamina es que 25 Shelver et ál. han generado anticuerpos para ractopamina derivados en el hidroxilo en la posición 1 (grupo hidroxilo en la cadena alifática) . Este grupo hidroxilo está ausente en la dobutamina. La presencia de un solo grupo hidroxilo en uno de los anillos aromáticos de los derivados de hapteno usados en la presente solicitud da como resultado un alto grado de especificidad para ractopamina, isoxsuprina y ritodrina. Los anticuerpos de la presente solicitud también son considerablemente más sensibles que los anticuerpos policlonales y monoclonales de Shelver. Para la ractopamina, el anticuerpo para el derivado en la posición 10 tiene una IC50 de 0, 082 ng/ml, mientras que el anticuerpo para el derivado en la posición 10' tiene una IC50 de 0, 202 ng/ml. Los presentes anticuerpos exhiben especificidad y sensibilidad mejoradas.... [Seguir leyendo]

1. Un método para preparar un hapteno de fórmula I

Hapteno I

adecuado para el uso en la producción de un anticuerpo capaz de unirse a al menos un epítopo estructural de una fenetanolamina tal como, pero no limitada a, ractopamina, isoxsuprina o ritodrina, comprendiendo el método la etapa de hacer reaccionar un derivado de fenetanolamina de la fórmula D, en la que Z1 es un reticulador, con un derivado de fenilalquilcarbonilo de la fórmula E, en la que Z2 es H; Y es independientemente H o CH3; W es independientemente H o CH3; n es independientemente 1 o 2; y m es independientemente 0 o 1

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el derivado de fenetanolamina de la fórmula D se prepara al hacer reaccionar hidrocloruro de octopamina con Z1X1, en el que X1 es un haluro, preferiblemente un bromuro.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el grupo amina del hidrocloruro de octopamina se protege temporalmente con BOC, al hacer reaccionar el hidrocloruro de octopamina con dicarbonato de di-terc-butilo

antes de hacer reaccionar el hidrocloruro de octopamina protegido con BOC con el Z1X1, retirándose subsiguientemente el grupo BOC.

4. Un método para preparar un hapteno de fórmula II

Hapteno II

adecuado para el uso en la producción de un anticuerpo capaz de unirse a al menos un epítopo estructural de una fenetanolamina tal como, pero no limitada a, ractopamina, isoxsuprina o ritodrina, comprendiendo el método la etapa de hacer reaccionar un derivado de fenetanolamina de la fórmula D, en la que Z1 es H, con un derivado de fenilalcoxicarbonilo de la fórmula E, en la que Z2 es un reticulador; Y es independientemente H o CH3; W es independientemente H o CH3; n es independientemente 1 o 2; y m es independientemente 0 o 1

5. Un método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el derivado de fenilalquilcarbonilo de la fórmula E se prepara al hacer reaccionar 4- (4-hidroxifenil) -2-butanona con Z2X1, en el que X1 es un haluro, preferiblemente un bromuro.

6. Un método para elaborar un inmunógeno, comprendiendo el método preparar un hapteno de acuerdo con el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3; y acoplar el hapteno a un material portador que confiere antigenicidad, seleccionándose preferiblemente el material portador del grupo que comprende una proteína, un fragmento de proteína, un polipéptido sintético y un polipéptido semisintético.

7. Un método para elaborar un inmunógeno, comprendiendo el método preparar un hapteno de acuerdo con el método de la reivindicación 4 o 5; y acoplar el hapteno a un material portador que confiere antigenicidad, seleccionándose preferiblemente el material portador del grupo que comprende una proteína, un fragmento de proteína, un polipéptido sintético y un polipéptido semisintético.

8. Un método para elaborar un anticuerpo, comprendiendo el método preparar un inmunógeno de acuerdo con el método de la reivindicación 6 e inmunizar un animal no humano con el inmunógeno, siendo capaz el anticuerpo de unirse a al menos un epítopo estructural de una fenetanolamina tal como ractopamina, isoxsuprina o ritodrina.

9. Un método para elaborar un anticuerpo, comprendiendo el método preparar un inmunógeno de acuerdo con el método de la reivindicación 7 e inmunizar un animal no humano con el inmunógeno, siendo capaz el anticuerpo de unirse a al menos un epítopo estructural de una fenetanolamina tal como ractopamina, isoxsuprina o ritodrina.

10. Un método para elaborar un conjugado, comprendiendo el método preparar un hapteno de acuerdo con el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3; y unir covalentemente el hapteno a un agente marcador detectable, seleccionándose preferiblemente el agente marcador del grupo que comprende una enzima, una sustancia luminiscente, una sustancia quimioluminiscente y una sustancia radiactiva.

11. Un método para elaborar un conjugado, comprendiendo el método preparar un hapteno de acuerdo con el método de la reivindicación 4 o 5; y unir covalentemente el hapteno a un agente marcador detectable, seleccionándose preferiblemente el agente marcador del grupo que comprende una enzima, una sustancia luminiscente, una sustancia quimioluminiscente y una sustancia radiactiva.