PROCEDIMIENTO PARA LA DIAGNOSIS DE ENFERMEDADES INFLAMATORIAS E INFECCIONES MEDIANTE LA DETERMINACIÓN DE LA INMUNORREACTIVIDAD DE LASP-1.

Procedimiento diagnóstico in vitro para la detección precoz y la detección,

para la prognosis evolutiva y la valoración del grado de severidad y como acompañamiento a la terapia para la valoración de la evolución de infecciones sistémicas análogas a la sepsis y de la sepsis, del infarto de miocardio y de la enfermedad de Alzheimer, en el que en una muestra de suero o plasma de un paciente se determina en forma libre y/o en forma unida a proteína o en forma modificada postranslacional la presencia y/o cantidad de la proteína LASP-1 (ID SEC Nº: 1) o de una proteína que sea secuencialmente idéntica a ésta al menos en la región de los primeros 200 aminoácidos y presente una inmunorreactividad correspondiente a la región mencionada, y de la presencia y/o cantidad de la inmunorreactividad de LASP-1 determinada se sacan conclusiones con respecto a la existencia de la infección sistémica análoga a la sepsis o de la sepsis, del infarto de miocardio o de la enfermedad de Alzheimer, a la evolución previsible o al grado de severidad de dichas enfermedades o al éxito de una terapia para las mismas

La presente invención se refiere a nuevos usos de la proteína LASP-1, así como dado el caso de proteínas estrechamente emparentadas con la misma y que presenten al menos con respecto a sus primeros 200 aminoácidos la misma secuencia como la LASP-1 y con ello una inmunorreactividad equiparable, así como de fragmentos de las mismas, para la diagnosis médica de sepsis y de infecciones sistémicas análogas a la sepsis, así como de infartos 5 de miocardio y de la enfermedad de Alzheimer, según la reivindicación 1. La invención se basa en la determinación que primeramente se hizo de concentraciones muy incrementadas de la proteína LASP-1 en el tejido cerebral de primates a los que se les produjo experimentalmente mediante administración de toxinas una sepsis o una inflamación sistémica, así como en la subsiguiente determinación de una inmunorreactividad de LASP-1 muy incrementada en la circulación de pacientes con sepsis y de pacientes de Alzheimer, habiéndose constatado una 10 correspondiente inmunorreactividad incrementada también en pacientes con infarto de miocardio.

Cuando en la siguiente descripción se habla de LASP-1, se entiende que este concepto no tan sólo designa a la conocida proteína LASP-1 con la concreta secuencia de aminoácidos que se indica en la ID SEC Nº: 1, sino dado el caso también a las proteínas emparentadas con la misma y que dentro de los primeros 200 aminoácidos son secuencialmente idénticas a esta LASP-1, como es el caso p. ej. de la proteína LAP-1, con respecto a la cual se dan 15 además explicaciones aclaratorias al final de la parte experimental de esta solicitud. Esta definición es válida para todas las referencias que se hagan a la LASP-1, a no ser que del contexto concreto se derive otra cosa para el experto en la materia. Cuando se habla de LASP-1, este concepto significa además también fragmentos con una inmunorreactividad de LASP-1, pudiendo todos los productos mencionados estar presentes tanto en forma libre como también dado el caso unidos a proteínas de unión y/o en una forma postranslacional modificada, o sea p. ej. 20 en forma glicosilada y/o fosforilada.

La presente invención tiene su origen en intensivos trabajos de investigación de la solicitante en relación con adicionales perfeccionamientos de la diagnosis y terapia de inflamaciones e infecciones.

Se designan como inflamaciones con carácter totalmente general determinadas reacciones fisiológicas de un organismo a distintos impactos externos tales como p. ej. traumatismos, quemaduras, alergenos o infecciones por 25 microorganismos tales como bacterias y hongos y virus, a tejidos foráneos que provocan reacciones de rechazo, o a determinados estados endógenos del cuerpo que provocan inflamaciones, como sucede p. ej. en el caso de las enfermedades autoinmunes y del cáncer. Las inflamaciones pueden surgir como reacciones inocuas y localmente limitadas del cuerpo, si bien son también características típicas de numerosas y severas afecciones crónicas y agudas de distintos tejidos, órganos y partes de órganos y tejidos. 30

Las inflamaciones locales son con ello en la mayoría de los casos parte de la reacción inmune sana del cuerpo a impactos dañinos, y son con ello parte del mecanismo de defensa del organismo para el mantenimiento de la vida. Cuando las inflamaciones son sin embargo parte de una reacción mal encaminada del cuerpo a determinados procesos endógenos, como sucede p. ej. en el caso de las enfermedades autoinmunes, y/o cuando dichas inflamaciones son de naturaleza crónica, o bien cuando las mismas alcanzan proporciones sistémicas, como 35 sucede en el caso del síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (Systemic Inflammatory Response Syndrome, SIRS) o bien en el caso de una sepsis severa debida a causas infecciosas, los procesos fisiológicos típicos de las reacciones inflamatorias quedan fuera de control y se convierten en un verdadero suceso de enfermedad que a menudo constituye una amenaza para la vida. En el contexto de la presente solicitud de patente se considera también como enfermedad que va acompañada de síntomas típicos de una inflamación, concretamente del cerebro, 40 a la enfermedad de Alzheimer, que está caracterizada por una inconteniblemente progresiva atrofia de la corteza cerebral que por regla general surge en el periodo que va de la 5ª a la 6ª década de vida, y que debido a su frecuencia reviste una gran importancia económica.

Hoy en día es sabido que la aparición y la evolución de procesos inflamatorios son controladas por un considerable número de sustancias que son preponderantemente de naturaleza proteínica o peptídica, y van 45 acompañadas de una aparición más o menos limitada en el tiempo de determinadas biomoléculas. Pertenecen a las sustancias endógenas que participan en reacciones inflamatorias en particular las que pueden contarse entre las citoquinas, los mediadores, las sustancias vasoactivas, las proteínas de fase aguda y/o los reguladores hormonales. La reacción inflamatoria constituye una compleja reacción fisiológica en la que participan tanto sustancias endógenas activadoras de la aparición de la inflamación (como p. ej. TNF-α, interleuquina-1) como sustancias 50 desactivadoras (como p. ej. interleuquina-10).

En las inflamaciones sistémicas como en el caso de una sepsis o del shock séptico las cascadas de reacción inflamatorio-específicas se extienden de manera incontrolada a todo el cuerpo y pasan con ello a constituir una amenaza para la vida, en el sentido de una excesiva respuesta inmune. Con respecto a los conocimientos actuales sobre la aparición y el posible papel que desempeñan distintos grupos de sustancias endógenas inflamatorio-55 específicas se hace por ejemplo referencia a A. Beishuizen et al., “Endogenous Mediators in Sepsis and Septic Shock”, Advances in Clinical Chemistry, Vol. 33, 1999, 55-131; y C. Gabay et al., “Acute Phase Proteins and Other Systemic Responses to Inflammation”, The New England Journal of Medicine, Vol. 340, Nº 6, 1999, 448-454. Puesto que en los últimos años han variado la comprensión de la sepsis y de las afecciones inflamatorias sistémicas emparentadas con la misma, y con ello también las definiciones reconocidas, se hace además referencia a K. 60 Reinhart et al., “Sepsis und septischer Schock”, en: Intensivmedizin, Georg Thieme Verlag, Stuttgart. New York,

2001, 756-760; donde se da una moderna definición del concepto de sepsis. En el marco de la presente solicitud los conceptos de sepsis y de afecciones (o enfermedades) inflamatorias se usan conforme a las definiciones que pueden extraerse de las tres referencias de la literatura anteriormente mencionadas.

Mientras que al menos en el ámbito europeo la infección bacteriana sistémica demostrable mediante un hemocultivo positivo ha acuñado durante largo tiempo el concepto de la sepsis, la sepsis se entiende hoy en día en 5 primera línea como inflamación sistémica que tiene causas infecciosas pero que como suceso de enfermedad presenta grandes similitudes con las inflamaciones sistémicas que son provocadas por otras causas. Corresponden a la mencionada variación de la comprensión de la sepsis las variaciones de los planteamientos diagnósticos. Así, la determinación directa de agentes causales bacterianos ha sido sustituida o completada por complejas supervisiones de parámetros fisiológicos y más recientemente en particular también por la determinación de determinadas 10 sustancias endógenas que participan en la aparición de la sepsis o en la aparición de la inflamación, es decir, de “biomarcadores” específicos.

De la gran cantidad de mediadores y proteínas de fase aguda de los que se sabe o se presume que participan en un suceso inflamatorio, son con ello adecuados a efectos diagnósticos en particular aquéllos cuya aparición es muy específica de afecciones inflamatorias o de determinadas fases o expresiones de afecciones 15 inflamatorias, cuyas concentraciones varían drásticamente y de manera significante para el diagnóstico, y que además presentan las estabilidades necesarias para las determinaciones rutinarias y alcanzan altos valores de concentración. A efectos diagnósticos está con ello en primer plano la fiable correlación de los sucesos de enfermedad (inflamación, sepsis) con el respectivo biomarcador (buena especificidad y selectividad), sin que tenga que ser conocido el papel que éste desempeña en la compleja cascada de las sustancias endógenas que participan 20 en el suceso inflamatorio.

Una sustancia endógena que es particularmente adecuada como biomarcador de sepsis es la procalcitonina.... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento diagnóstico in vitro para la detección precoz y la detección, para la prognosis evolutiva y la valoración del grado de severidad y como acompañamiento a la terapia para la valoración de la evolución de infecciones sistémicas análogas a la sepsis y de la sepsis, del infarto de miocardio y de la enfermedad de Alzheimer, en el que en una muestra de suero o plasma de un paciente se determina en forma libre y/o en forma unida a proteína o en forma modificada postranslacional la presencia y/o cantidad de la proteína 5 LASP-1 (ID SEC Nº: 1) o de una proteína que sea secuencialmente idéntica a ésta al menos en la región de los primeros 200 aminoácidos y presente una inmunorreactividad correspondiente a la región mencionada, y de la presencia y/o cantidad de la inmunorreactividad de LASP-1 determinada se sacan conclusiones con respecto a la existencia de la infección sistémica análoga a la sepsis o de la sepsis, del infarto de miocardio o de la enfermedad de Alzheimer, a la evolución previsible o al grado de severidad de 10 dichas enfermedades o al éxito de una terapia para las mismas.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que en la determinación se determina o se codetermina la inmunorreactividad de una proteína o de un fragmento de la misma al que se denomina LAP-1 y que presenta la secuencia de aminoácidos según la ID SEC Nº: 16.

3. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado por el hecho de que en la 15 determinación se determina una inmunorreactividad que puede atribuirse a las posiciones 147 a 187 de LASP-1 (ID SEC Nº: 1).

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por el hecho de que se determina la inmunorreactividad de una forma soluble formada postranslacionalmente de LASP-1 y/o LAP-1.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por el hecho de que es un 20 procedimiento de determinación inmunodiagnóstica (inmunoensayo) del tipo sándwich.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por el hecho de que es un procedimiento de determinación inmunodiagnóstica en el que se usan reactivos anticuerpos que fueron producidos mediante inmunización con un péptido conjugado con una proteína portadora, siendo dicho péptido seleccionado de entre los péptidos que tienen las secuencias de aminoácidos según la ID SEC Nº: 25 13, la ID SEC Nº: 14 o la ID SEC Nº: 17.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por el hecho de que es un procedimiento para la diagnosis de la sepsis, y dentro del marco de una determinación multiparamétrica se determina además de la inmunorreactividad de LASP-1 al menos un parámetro adicional que se selecciona de entre los miembros del grupo que consta de procalcitonina, CA 125, CA 19-9, S100B, 30 proteínas S100A, fragmentos de citoqueratina solubles, y en particular CYFRA 21, TPS y/o fragmentos de citoqueratina-1 solubles (sCY1F), los péptidos inflamina y CHP, prohormonas peptídicas, la glicina-N-aciltransferasa (GNAT), la carbamoilfosfato sintetasa 1 (CPS 1) y la proteína C-reactiva (CRP) o fragmentos de los mismos.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado por el hecho de que la determinación 35 multiparamétrica se efectúa como determinación simultánea mediante un dispositivo de medición con tecnología de chips o un dispositivo de medición inmunocromatográfica.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, caracterizado por el hecho de que la evaluación del complejo resultado de medición obtenido con el dispositivo de medición se hace con ayuda de un programa de ordenador. 40

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por el hecho de que se efectúa una determinación de LASP-1 y LAP-1 de forma tal que se determinan ambas juntamente.

11. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por el hecho de que determinación de LASP-1 y/o LAP-1 se efectúa de forma tal que se obtienen valores de medición que son característicos de la presencia y/o de cantidades de solamente LASP-1 o de solamente LAP-1. 45