PROCEDIMIENTO PARA LA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS EN FLUIDOS CORPORALES MEDIANTE UNA REACCIÓN INMUNITARIA CON GLICOPROTEÍNA 2 (GP2) DE GRÁNULOS DE ZIMOGENO DEL PÁNCREAS PARA EL DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL DE ENFERMEDADES INFLAMATORIAS DEL INTESTINO Y PANCREATITIS CRÓNICA.

Procedimiento para la detección de anticuerpos en fluidos corporales mediante una reacción inmunitaria con glicoproteína 2 (GP2) de gránulos de zimógeno del páncreas para el diagnóstico diferencial de enfermedades inflamatorias del intestino y pancreatitis crónica La invención se refiere a un procedimiento para la detección de anticuerpos en heces y/o fluidos corporales mediante una reacción inmunitaria con GP2 de gránulos de zimógeno del páncreas o sus secuencias inmunorreactivas El procedimiento puede servir para el diagnóstico o el control terapéutico de enfermedades, que van acompañadas de una reacción inmunitaria contra GP 2 y sus sustancias análogas. Por tanto es objeto de la invención el uso de GP2, o sus secuencias inmunorreactivas para el diagnóstico o el control terapéutico de enfermedades inflamatorias del intestino crónicas, seleccionadas del grupo que comprende enfermedad de Crohn (EC), pancreatitis crónica (PC), y colitis ulcerosa (CU). La presente invención se apoya en el conocimiento de que GP2 es un autoantígeno de procesos inmunitarios en enfermedades inflamatorias del intestino (EII), preferentemente en EC y PC y por tanto un epítopo de los anticuerpos asociados con la enfermedad. GP2 es una glicoproteína de membrana de células acinares del páncreas con un peso molecular aparente de 78 kD. Además se detectó GP2 en los enterocitos del intestino y también como componente de lisosomas o como péptido libre, no unido a la membrana, en el jugo pancreático. Representa con el 30-45 % de la proteína de membrana total, el componente principal de la membrana de gránulos de zimógeno. Junto con otras proteínas pancreáticas secretoras de los gránulos de zimógeno tales como sincolina, lectina ZG16p, sinaptobrevina 2 y diferentes proteoglicanos de matriz de sulfato GP2 es un componente de las balsas lipídicas (lipid rafts) de la membrana de gránulos, en la que sincolina interacciona con GP2. Estos complejos, a los que pueden pertenecer aún otras proteínas tales como ZG46p, forman la matriz submembanosa. A través de un anclaje de fosfatidilinositol, GP2 está unida a la membrana de los gránulos zimógenos de las células acinares del páncreas y puede desprenderse por ejemplo mediante fosfolipasa C de B. cereus. Los gránulos zimógenos son cámaras de reserva de enzimas digestivas tales como por ejemplo amilasa en las células acinares del páncreas. Tras la estimulación neuronal u hormonal de las células acinares se secretan las enzimas digestivas a los conductos pancreáticos. Además de la localización de GP2 en la membrana de gránulos zimógenos, se encuentra también en la matriz, en el aparato de Golgi así como en el jugo pancreático en las luces de los acinos. Además existen indicaciones de que GP2 es un componente de los lisosomas y por consiguiente participa en la endocitosis. Durante la estimulación de la secreción pancreática, GP2 se transporta hacia la superficie de membrana apical de las células acinares, se desprende y se libera en la luz acinar. Debido a la cantidad relativamente grande de GP2 en el jugo pancreático se especula que existe un conjunto celular adicional, a partir del cual puede secretarse GP2. En contraposición a las enzimas digestivas, que se activan mediante proteolisis en el intestino, GP2 se modifica ya en la célula acinar mediante ruptura. Se supone que la proteolisis secuencial intracelular de la GP2 influye en su función. Dado que los niveles en suero de GP2 son elevados en caso de pancreatitis crónica y aguda, se discute la idoneidad de GP2 como marcador para el diagnóstico serológico de estas entidades. En un modelo de rata pudo demostrarse que la concentración en suero de GP2 está correlacionada con el grado de gravedad de las enfermedades inflamatorias del intestino. Para las líneas celulares de ser humano no ha podido demostrarse hasta el momento de manera incuestionable esta relación de que los niveles de GP2 detectables a través de los autoanticuerpos presentan una variabilidad individual considerable. A pesar de esta desventaja, una serie de planteamientos para el desarrollo de procedimientos de diagnóstico se basa en la producción y detección de los anticuerpos, que están dirigidos frente a GP2, para, con ayuda de la reacción con los anticuerpos, determinar el grado de gravedad de enfermedades inflamatorias del intestino. Entre las enfermedades inflamatorias del intestino EC y colitis ulcerosa (CU) representan las dos más importantes. Se caracterizan por procesos inflamatorios crónicos, recurrentes, que destruyen los tejidos en el sistema digestivo. La etiología y patogénesis de la EC así como de la CU quedan aún por esclarecer. Mientras que en el caso de la CU la inflamación aparece sobre todo en la mucosa y submucosa del colon y del recto, en el caso de la EC son característicos procesos de inflamación granulomatosa, que intervienen en la pared de todo el tracto gastrointestinal. Factores genéticos así como ambientales parecen desempeñar un papel decisivo en la formación de EII. La relación entre las mutaciones en el gen NOD2 y la aparición de la EC ha de considerarse garantizada en varias cohortes. Asimismo existe una asociación clara para la aparición de la EC en el íleo terminal. Hasta el momento no ha podido 2   establecerse una relación entre los marcadores genéticos y el desarrollo de la terapia para ningún procedimiento de tratamiento (incluyendo la terapia anti-TNF). La incidencia de EC en Europa se encuentra en 5,6 por 100.000 al año. La prevalencia de EC en Alemania se indica con 1/500 a 1/800. Los primeros síntomas de enfermedad de EC aparecen de media relativamente temprano a los 30 años. Por consiguiente, los pacientes con EC ven afectada su vida profesional, lo que acarrea efectos socioeconómicos correspondientes. De manera similar al caso de la CU, en el caso de pacientes con EC con colitis de Crohn y un transcurso de muchos años, la incidencia de carcinoma es elevada. Las quejas comprenden dolores abdominales, diarrea, malabsorción, abscesos, fístulas, complicaciones por cálculos biliares, cálculos renales y sus complicaciones. Los pacientes con EC pueden presentar una serie de manifestaciones extraintestinales, apareciendo la pancreatitis con un 3,5 % relativamente pocas veces en pacientes con EC. Una hiperamilasemia e hiperlipasemia sin síntomas de una pancreatitis aguda puede observarse sin embargo en el 8-17 % de los pacientes, lo que indica una mayor tasa de pancreatitis silenciosa. Las modificaciones en el conducto pancreático son aisladas y se han descrito reducciones de la función pancreática. La elevación de la hiperamilasemia e hiperlipasemia está correlacionada con la actividad de la EC. En un 4,6 % de los pacientes con EC se encuentran al mismo tiempo modificaciones en los conductos pancreáticos y biliares de manera similar al caso de los pacientes con colangitis esclerosante primaria. No obstante, la pancreatitis crónica en pacientes con EC se diferencia en general de aquélla en el caso de CU, que con mayor frecuencia presenta una implicación de los conductos biliares, pérdida de peso y estenosis de los conductos biliares. Se discute la existencia de una pancreatitis crónica idiopática, que está asociada con la EC. A diferencia de la pancreatitis crónica asociada con CU, en el caso de pacientes con EC los síntomas intestinales aparecen con mayor frecuencia antes de la aparición de hallazgos pancreáticos. La frecuente insuficiencia pancreática exocrina en la EC puede atribuirse fácilmente a la pronunciada degeneración acinar, que va acompañada de densos infiltrados inflamatorios en el parénquima. Como terapia se recomienda la administración de ácido 5-aminosalicílico, aunque diferentes estudios han llamado la atención sobre desventajas notables, dado que con este principio activo sólo se conseguían efectos limitados o ningún efecto. La aplicación surge sin embargo en pacientes con un brote de gravedad de ligera a moderada debido a los datos existentes de manera absolutamente justificada, cuando en caso de ineficacia se inicia a tiempo un cambio de terapia. En el caso de un brote grave sin complicaciones ha tomarse en consideración la administración de equivalentes de prednisolona. Si se producen brotes frecuentes ( 2/año), puede administrarse adicionalmente azatioprina o 6-mercaptopurina. Los costes totales de un paciente con EC en Alemania se calculan en 20.000 euros por año y caso. Las aplicaciones para pacientes con EC incluyendo los costes indirectos en Alemania se elevan 2 mil millones de euros calculados, en los EE.UU. se indican para ambas EII 2,6 mil millones de dólares estadounidenses como costes socioeconómicos. Los preparados de anticuerpos anti-TNFalfa son eficaces en la EC e inducen la remisión de la enfermedad crónica. No obstante, en estos preparados son desventajosos los efectos secundarios,... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la detección de anticuerpos en heces y/o fluidos corporales especialmente sangre y/o suero para el diagnóstico y/o el control terapéutico de enfermedades inflamatorias del intestino, seleccionadas del grupo que comprende enfermedad de Crohn, pancreatitis crónica y/o colitis ulcerosa, mediante una reacción inmunitaria con GP2 según la SEQ ID NO. 1, o una molécula que presenta una secuencia de aminoácidos, que presenta una homología con la SEQ ID NO. 1, ascendiendo la homología al menos al 80 %, preferiblemente al 90 %, comprendiendo la reacción inmunitaria una unión de un anticuerpo a un antígeno y siendo GP2 según la SEQ ID NO. 1 el antígeno. 2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la detección se realiza en un inmunoensayo, preferiblemente con acoplamiento directo o indirecto de un componente de reacción con una sustancia de marcado excluyendo pruebas de inmunofluorescencia a base de secciones de tejido. 3. Uso de la molécula GP2 según la SEQ ID NO. 1 como antígeno para el diagnóstico y/o el control terapéutico de enfermedades inflamatorias del intestino (EII), teniendo lugar el diagnóstico y/o el control terapéutico ex vivo. 4. Uso de la molécula GP2 según la reivindicación 3, caracterizado porque la enfermedad inflamatoria del intestino es enfermedad de Crohn, pancreatitis crónica y/o colitis ulcerosa. 5. Uso de la molécula GP2 según una de las reivindicaciones 3 o 4, caracterizado porque la molécula GP2 está presente de forma lineal o en forma cilíndrica, teniendo lugar la ciclación de péptido en el caso de la existencia de dos cisteínas mediante enlace puente disulfuro o mediante ciclación de amida, que tienen lugar de manera opcional a través de las cadenas laterales, a través de los extremos C y N terminales o mediante una combinación de estas posibilidades. 6. Uso de GP2 según la SEQ ID NO. 1 según una o varias de las reivindicaciones anteriores, para el diagnóstico y/o el control terapéutico de enfermedades inflamatorias del intestino, usándose GP2 según la SEQ ID NO. 1 de forma soluble o unida a la fase sólida para la detección directa o indirecta de autoanticuerpos en fluidos corporales, especialmente sangre, suero y/o heces. 7. Uso de GP2 según la SEQ ID NO. 1 según una o varias de las reivindicaciones anteriores, en el que la molécula GP2 unida a la fase sólida según la SEQ ID NO. 1 está unida a polímeros orgánicos, inorgánicos, sintéticos y/o mixtos, preferiblemente agarosa, celulosa, gel de sílice, poliamidas y/o poli(alcoholes vinílicos). 8. Uso de GP2 según la SEQ ID NO. 1 o una molécula que presenta una secuencia de aminoácidos, que presenta una homología con la SEQ ID NO. 1, ascendiendo la homología al menos al 80 %, preferiblemente al 90 %, para la producción de un medicamento para su aplicación en el diagnóstico y/o el control terapéutico de enfermedades inflamatorias del intestino, seleccionadas del grupo que comprende enfermedad de Crohn, pancreatitis crónica y/o colitis ulcerosa, que van acompañadas de una reacción inmunitaria contra estas sustancias, usándose GP2 según la SEQ ID NO. 1 como antígeno y uniéndose a autoanticuerpos. 9. Uso de GP2 preferentemente según la SEQ ID NO. 1 o una molécula que presenta una secuencia de aminoácidos, que presenta una homología con la SEQ ID NO. 1, ascendiendo la homología al menos al 80 %, preferiblemente al 90 %, para la producción de un medicamento para su aplicación en el diagnóstico oral y/o el control terapéutico de enfermedades inflamatorias del intestino, seleccionadas del grupo que comprende enfermedad de Crohn, pancreatitis crónica y/o colitis ulcerosa, que van acompañadas de una reacción inmunitaria contra estas sustancias, usándose GP2 según la SEQ ID NO. 1 como antígeno y uniéndose a autoanticuerpos.