KIT PARA MEDIR LA PRODUCCIÓN DE TROMBINA EN UNA MUESTRA DE SANGRE O PLASMA DE UN PACIENTE.

Kit para medir la producción de trombina en una muestra de sangre o plasma de un paciente La presente invención se refiere a un kit para medir la producción de trombina en una muestra de sangre o plasma de un paciente o en una muestra de factores de coagulación. La invención también se refiere a un proceso para la preparación de un reactivo para el kit. La hemofilia A es un trastorno de la coagulación sanguínea hereditario. Está producida por una actividad deficiente de la proteína plasmática factor VIII, que afecta a las propiedades de coagulación de la sangre. El tratamiento estándar para pacientes de hemofilia A es la infusión de concentrados de factor VIII para sustituir el factor de coagulación defectuoso. Sin embargo, los pacientes de hemofilia A que desarrollan inhibidores del factor VIII durante la terapia sustitutiva no responden a la mencionada terapia y se tratan con preparados que contienen factores de coagulación activados (denominados agentes de by-pass agentes de desvío) para lograr una hemostasia independiente del factor VIII mediante mecanismos de by-pass (derivación). Tanto los concentrados de complejo de protrombina activada (APCC), como FEIBA (FActor Eight Inhibitor By-passing Activity - actividad de derivación del inhibidor de factor VIII APCC derivado de plasma), que activa la vía intrínseca o común, y el factor activado VIIa (rFVIIa), tal como NovoSeven (VIIa recombinante), destinado a actuar a través de la vía extrínseca, son opciones adecuadas para el tratamiento de pacientes de inhibición del factor VIII. No es posible la supervisión directa del principio activo para uno u otro régimen de tratamiento, ya que los componentes activos de los agentes de derivación interactúan inmediatamente con las proteínas del sistema hemostático para inducir una activación de la cascada de coagulación. Todos los ensayos existentes miden marcadores indirectos, cuyo valor es limitado para evaluar la eficacia del agente de derivación, debido a que la especificidad y la sensibilidad dependen de las condiciones de ensayo específicas y debido a que estos ensayos no aportan información alguna sobre el estado de la actividad global del sistema hemostático. El objetivo final de la cascada de coagulación es la transformación de la protrombina en trombina, la cual, a su vez, induce la formación de coágulos mediante la activación del fibrinógeno. Por tanto, la producción de trombina es una función fundamental del plasma en la hemostasis. Actualmente no existe un ensayo rutinario que evalúe cuantitativamente la capacidad de formación de trombina en una muestra de plasma. Los tiempos de coagulación, tales como el tiempo de protrombina (PTT), el tiempo de tromboplastina parcial activado (aPTT) y el tiempo de coagulación de trombina (TCT), no reflejan la producción de trombina global, ya que la mayoría de la trombina se forma después del instante de la coagulación y, por tanto, no son sensibles a la hipercoagulación y, posiblemente, tampoco a estados de hipocoagulación. El ensayo PTT mide el tiempo de coagulación de la vía extrínseca y común, el ensayo aPTT mide el tiempo de coagulación de la vía intrínseca y común, mientras que el ensayo TCT sólo mide el tiempo de coagulación de la vía común. Hemker y col. (1986, Thromb. Haemost. 56:9-17) fueron los primeros en sugerir la medida de la producción de trombina en el plasma del paciente mediante la evaluación del potencial de trombina endógena. La producción de trombina es un proceso dinámico. La concentración de trombina real depende de la velocidad de activación e inactivación de las reacciones y, por tanto, refleja la eficiencia del sistema hemostático para controlar el sangrado. Hemker y col. (1995, Thromb. Haemost. 74:134-138) definieron el potencial de la trombina como la capacidad global del plasma para formar trombina después de la inducción de la coagulación y propusieron el uso de este parámetro como indicador sensible de todas las formas de anticoagulación. Sultan y Loyer (1993, J. Lab. Clin. Med. 121:444-452) utilizaron tal ensayo de producción de trombina para la evaluación in vitro de la actividad de corrección del inhibidor de factor VIII en concentrados de complejo de protrombina activada, en concentrados de complejo de protrombina y de factor VIIa en plasma de pacientes con inhibidores de factor VIII. También existen otros informes de pruebas similares utilizadas para evaluar la eficacia de los agentes de derivación del factor VIII, aunque, debido a su complejidad técnica, las pruebas no se han aplicado al uso rutinario. Turecek y col. (2003, Pathophysiol. Haemost. Thromb. 33:16-22) también describieron ensayos de producción de trombina; sin embargo, no utilizaron componentes liofilizados. Por otra parte, existe la opinión común de que la liofilización disminuye la actividad del factor tisular. Además, la patente US-5.418.141 describe un artículo y un método de ensayo para realizar pruebas de tiempo de protrombina con un reactivo seco y la WO 98/48283 describe reactivos líquidos y liofilizados para determinar el tiempo de protrombina y/o los niveles de fibrinógeno en una muestra de plasma. Todos los ensayos conocidos del estado de la técnica tienen el inconveniente de que los componentes sólo se pueden dosificar parcialmente antes de aplicar el ensayo. Por tanto, es necesaria una gran cantidad de fases de preparación para utilizar estas pruebas, haciendo así que éstas sean incómodas y susceptibles de error durante la manipulación. Además, estos ensayos requieren mucho tiempo. Por tanto, existe la necesidad de un sistema de prueba que permita la detección y determinación de cambios, por ejemplo cambios que dependan del tratamiento, en la cinética de la producción de trombina en una muestra de sangre o plasma de un paciente y que solucione los problemas antes mencionados. 2 ES 2 367 439 T3 Un objeto de la presente invención es proporcionar un kit para medir la producción de trombina en una muestra de sangre o plasma de un paciente o en una muestra de factores de coagulación. El kit comprende un complejo liofilizado de factor tisular (TF)/fosfolípido (PL) y una mezcla liofilizada que contiene un sustrato de trombina con un marcador fluorescente y de CaCl2, donde la mezcla liofilizada forma una solución límpida cuando se disuelve en una solución acuosa. Además, el kit de la presente invención también puede contener cualquier agente auxiliar, por ejemplo tampones, sales, por ejemplo CaCl2, estándares de trombina, estándares de FEIBA, etc., en forma congelada o liofilizada. El kit de la presente invención puede estar presente en cualquier forma, por ejemplo inmovilizado o en un soporte. Sorprendentemente, se ha descubierto que un complejo liofilizado TF/PL y una mezcla liofilizada que contiene un sustrato de trombina con un marcador fluorescente y CaCl2, donde la mezcla liofilizada forma una solución límpida cuando se disuelve en una solución acuosa, proporcionan un sistema de ensayo simple, eficiente, rápido y reproducible para medir la producción de trombina en una muestra. El kit de la presente invención proporciona al menos un complejo liofilizado de TF/PL y una mezcla liofilizada que contiene un sustrato de trombina con un marcador fluorescente y CaCl2, donde la mezcla liofilizada forma una solución límpida cuando se disuelve en una solución acuosa, en una forma liofilizada fácilmente soluble, con lo cual sólo se necesita la adición a ensayar. El complejo liofilizado de TF/PL y la citada mezcla liofilizada que contiene un sustrato de trombina con un marcador fluorescente y CaCl2 del kit reivindicado también se pueden inmovilizar sobre un soporte, tal como la superficie interna de un vial o el pocillo de una placa microtitulada, con lo cual el ensayo de producción de trombina se lleva a un formato de ensayo conocido del tipo ELISA convencional, haciendo de él un tipo de ensayo muy conveniente. El kit de la presente invención proporciona al menos la misma sensibilidad en la prueba de producción de trombina que los ensayos del estado de la técnica utilizando componentes congelados. Por tanto, el ensayo de producción de trombina desarrollado con el kit de la presente invención permite un diagnóstico rápido del estado activo global del sistema hemostático en un paciente. Además, es posible detectar cambios dependientes del tratamiento en la cinética de la producción de trombina, por ejemplo después de la administración de una terapia de derivación a un paciente, por lo que es posible optimizar los intervalos de tratamiento y las dosis terapeúticas que ayudan a evitar complicaciones trombóticas por sobredosis. Fig. 1: muestra los cambios de temperatura durante un ciclo de liofilización del complejo de TF/PL. El largo ciclo de liofilización con pequeños cambios de gradiente de temperatura durante el período de secado principal... [Seguir leyendo]

1. Kit para medir la producción de trombina en una muestra, comprendiendo un complejo liofilizado de factor tisular (TF)/fosfolípido (PL) y una mezcla liofilizada de un sustrato de trombina con un marcador fluorescente y CaCl2, donde la mezcla liofilizada forma una solución límpida cuando se disuelve en una solución acuosa. 2. Kit según la reivindicación 1, caracterizado porque la concentración de TF en el complejo liofilizado de TF/PL oscila entre aproximadamente 5 y aproximadamente 1.000 pM. 3. Kit según la reivindicación 1, caracterizado porque la concentración de PL en el complejo liofilizado de TF/PL oscila entre aproximadamente 1 y aproximadamente 100 M. 4. Kit según la reivindicación 1, caracterizado porque dicho TF o al menos una parte funcional del mismo es de origen natural o recombinante. 5. Kit según la reivindicación 1, caracterizado porque dicho PL es de origen natural o sintético. 6. Kit según la reivindicación 1, caracterizado porque dicho PL se selecciona del grupo que consiste en fosfatidilserina (PS), fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE) y mezclas de los mismos. 7. Kit según la reivindicación 6, caracterizado porque la relación en peso PC/PS oscila entre aproximadamente 60/40 y aproximadamente 95/5. 8. Kit según la reivindicación 6, caracterizado porque la relación en peso PC/PS/PE se encuentra en el rango de aproximadamente 60/20/20 y aproximadamente 78/17/5, en base a la cantidad total de fosfolípidos. 9. Kit según la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además al menos un estándar de trombina. 10. Kit según la reivindicación 1, caracterizado porque el complejo liofilizado de TF/PL se inmoviliza sobre un soporte. 11. Kit según la reivindicación 1, caracterizado porque la mezcla liofilizada de un sustrato de trombina con un marcador fluorescente y CaCl2 se inmoviliza sobre un soporte. 12. Kit según la reivindicación 10 u 11, caracterizado porque el soporte es la superficie interna de un vial o de pocillos de una placa o de una banda ELISA. 13. Proceso para preparar una mezcla liofilizada de un sustrato de trombina con un marcador fluorescente y CaCl2, que comprende los siguientes pasos: a) disolver un sustrato de trombina con un marcador fluorescente en un disolvente adecuado; b) añadir CaCl2 y disolver el precipitado formado del sustrato de trombina con un marcador fluorescente y CaCl2; y c) liofilizar la mezcla del sustrato de trombina con un marcador fluorescente y CaCl2, donde la mezcla liofilizada forma una solución límpida cuando se disuelve en una solución acuosa. 14. Proceso según la reivindicación 13, caracterizado porque en el paso (c) se inmoviliza la mezcla sobre un soporte mediante liofilización. 15. Proceso según la reivindicación 14, caracterizado porque el soporte es la superficie interna de un vial o de pocillos de una placa o de una banda ELISA. 16. Método para medir la producción de trombina en una muestra, que comprende los pasos de: a) poner en contacto la muestra con un complejo liofilizado de factor tisular (TF)/fosfolípido (PL) y una mezcla liofilizada de un sustrato de trombina y CaCl2, donde la mezcla liofilizada forma una solución límpida cuando se disuelve en una solución acuosa; b) medir la producción de trombina en dicha muestra. ES 2 367 439 T3 17. Método según la reivindicación 16, caracterizado porque la muestra se selecciona del grupo consistente en sangre completa, plasma y mezclas que contienen proteínas purificadas de origen natural, sintético o recombinante con actividad hemostática. 9 FIGURA 1 Temperatura (ºC) ES 2 367 439 T3 Tiempo (horas) FIGURA 2 Trombina (nM) Trombina (nM) Trombina (nM) Trombina (nM) ES 2 367 439 T3 Trombina (nM) Tiempo (min) Tiempo (min) Trombina (nM) Trombina (nM) Tiempo (min) Tiempo (min) Trombina (nM) Tiempo (min) Tiempo (min) Tiempo (min) Tiempo (min) 11 FIGURA 3 Trombina (nM) Trombina (nM) Trombina (nM) ES 2 367 439 T3 Trombina (nM) Trombina (nM) Trombina (nM) 12 FIGURA 4 Trombina (nM) Pico de trombina (nM) Plasma humano normal ES 2 367 439 T3 Tiempo (min) Plasma inhibidor de factor VIII 13 FIGURA 5 Pico de trombina (nM) Pico de trombina (nM) ES 2 367 439 T3 14 Pico de trombina (nM) Pico de trombina (nM)