FRAGMENTO DE ANTICUERPO DE CADENA PESADA VH-CH1-VH-CH1 LINEAL.

Fragmento de anticuerpo de cadena pesada vh-ch1-vh-ch1 lineal ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Campo de la invención [0001] Esta invención se refiere, en general, a la purificación de anticuerpos. En particular, la invención se refiere a un procedimiento para recuperar un fragmento de anticuerpo de las variantes, impurezas y contaminantes asociados a él. Descripción de la técnica relacionada [0002] La cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) es una herramienta útil para separar moléculas en base a su hidrofobicidad. Generalmente, las moléculas de la muestra se cargan en una columna de HIC en un tampón de salinidad elevada. La sal en la solución tampón interacciona con las moléculas de agua para reducir la solvatación de las moléculas en solución, debido a eso se exponen las regiones hidrofóbicas en las moléculas de la muestra que son por lo tanto absorbidas por la columna de HIC. Cuanto mas hidrofóbicas sean las moléculas, menos sal se necesita para promover la asociación. Normalmente, se utiliza un gradiente salino decreciente para separar las muestras de la columna. A medida que disminuye la fuerza iónica, aumenta la exposición de las regiones hidrofóbicas de las moléculas y las moléculas se separan de la columna para aumentar la hidrofobia. Se puede conseguir también la separación de la muestra añadiendo al tampón de elución modificadores orgánicos o detergentes suaves. La HIC es revisada en Protein Purification 2d Ed., Springer-Verlag. New York, pgs. 176-179(1988). [0003] La HIC ha sido utilizada por varios investigadores para la purificación de anticuerpos. Danielsson et al., Journal of Immunological Methods 115:79-88 (1988) encontró que la HIC era particularmente útil en la purificación de anticuerpos monoclonales de las ascitis del ratón cuando el punto isoeléctrico de los anticuerpos estaba por debajo de 7,2. Se hizo la HIC con una columna de Alkyl Superose HR. El sistema tampón fue fosfato de 0,1M, con la adición de sulfato de amonio. Normalmente, el tampón inicial contenía sulfato de amonio 2M. Bridonneau et al., Journal of Chromatography 616: 197-204 (1993) estaban interesados en determinar, si se podía o no utilizar diferentes columnas HIC para la purificación selectiva de las subclases de la inmunoglobulina G humana (1gG). Los anticuerpos se adsorbieron en columnas de Fenil-, Butil-, u Octil-Sefarosa en sulfato de amonio (pH 7,0) y se separaron con un gradiente salino decreciente. El medio de Octil-Sefarosa produjo una fracción pobremente absorbida algo enriquecida en IgG2a. Ver también Berkovich et al., Journal of Chromatography 389:317-321 (1987); Gagnon et al.(90th Annual Meeting, American Society for Microbiology, Anaheim, May 13-17, 1990) Abstract No. 0-4; Johansson et al. Biol, Recombinant Microorg. Anim. Cells, (Oholo 34 Meeting), 409-414 (1991); Pavlu et al., Journal of Chromatography 359:449-460 (1986) y Abe et al., Journal of Biochemical and Biophisical Methods 27:215-227(1993) sobre HIC de anticuerpos. [0004] La HIC ha sido también utilizada para purificar fragmentos de anticuerpo. Inouye et al., Protein Engineering pgs. 6, 8 y 1018-1019 (1993); Inouye et al., Animal Cell Technology: Basic & Applied Aspects 5:609-616(1993); Inouye et al.,Journal of Biochemical and Biophysical Methods 26:27-39 (1993) y Marimoto et al.,Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) prepararon fragmentos F(ab)2 digiriendo con pepsina anticuerpos monoclonales IgM de ratón utilizando una columna HIC de gel TSK Ether-5PW.Los fragmentos de anticuerpos fueron salados con sulfato de amonio al 60% y los precipitados se disolvieron en un salino tamponado de fosfato (PBS, pH 7,4) que contenía sulfato de amonio 1M. Esta solución fue cargada en una columna HIC que había sido equilibrada con PBS que contenía también sulfato de amonio 1M. Los fragmentos F(ab)2 que se adsorbieron en la columna fueron separados reduciendo en el tampón de elución la concentración de sulfato de amonio a 0 M. Inouye et al. encontraron que la fracción que contenía el F(ab)2 era homogénea tanto mediante SDS-PAGE como mediante HPLC de filtración en gel. El procedimiento era adecuado para la purificación a gran escala de fragmentos de F(ab)2. Del mismo modo, Rea et al., Journal of Cell, Biochem.Suppl. 0, Abstract No. X1-206 (17 Part A), p.50 (1993) evaluaron la HIC para la purificación de un fragmento F(ab)2 producido por la digestión péptica de un anticuerpo IgG2a monoclonal de murina. La etapa de HIC precedió a la purificación de la proteína A para eliminar el anticuerpo residual intacto. Se probó para diferentes sales y pHs el funcionamiento de la purificación en tres columnas diferentes de HIC. Hallaron que la columna de POROS PE (fenil éter) era la mejor y que el sulfato de sodio tamponado con en fosfato a pH 8 dio la mejor resolución del fragmento de F(ab)2. [0005] EP 0517024 A2 (Behringwerke AG), se refiere a receptores biespecíficos tetravalentes, a su preparación y usos. [0006] Mallender et al., The Journal of Biological Chemistry, vol 269 no. 1: 199-206 (1994), describe la construcción, expresión y actividad de un anticuerpo de cadena simple biespecífico bivalente. DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN ES 2 365 929 T3 [0007] En comparación con las técnicas HIC descritas arriba, que se llevan a cabo generalmente a un pH aproximadamente neutro en presencia de altas concentraciones de sal (utilizando un gradiente de sal para eluir el anticuerpo), la presente descripción se refiere a cromatografía de interacción hidrofóbica a pH bajo (LPHIC) para la purificación de anticuerpos. Preferentemente, la LPHIC se lleva a cabo a bajas concentraciones de sales, por ejemplo alrededor de 0-0.25M de sal, preferentemente alrededor de 0-0.1M de sal y más preferentemente a 0-50mM de sal. Esta 2 baja concentración de sal también aplica al tampón de carga. Preferentemente, no se usa gradiente de sal para eluir el anticuerpo. [0008] Se describe aquí un proceso para purificar un anticuerpo de un contaminante que comprende cargar una mezcla que contiene el anticuerpo y el contaminante en una columna de cromatografía de interacción hidrofóbica y eluir el anticuerpo de la columna con un tampón que tenga un pH de alrededor 2.5-4.5. Preferentemente el tampón está a un pH de alrededor de 2.8-3.5 y más preferentemente a un pH de alrededor de 3.1. Habitualmente, la mezcla cargada en la columna está al mismo pH que el tampón de elución. [0009] El método es particularmente útil para purificar fragmentos de anticuerpos, especialmente fragmentos de anticuerpos unidos por disulfuros y correctamente plegados (p.ej. fragmentos Fab) de fragmentos de anticuerpo contaminantes que no están plegados correctamente y/o unidos por disulfuros. Los inventores han identificado un problema asociado con la formación de inmunoglobulinas recombinantes. Se ha observado que dicha producción resulta en la formación de anticuerpos funcionales F(ab)2, así como una variedad de fragmentos pesados y ligeros asociados incorrectamente. La impureza más difícil de eliminar ha sido identificada aquí como un fragmento de anticuerpo correctamente plegado, cuyas cadenas pesada y ligera no se asocian mediante enlace disulfuro. Esta impureza de anticuerpo puede detectarse por geles SDS PAGE y HPLC de fase reversa como cadenas ligera y pesada. La LPHIC descrita aquí aporta medios para remover sustancialmente este contaminante de composiciones parcialmente purificadas derivadas de células huésped que producen el fragmento de anticuerpo recombinante, aunque no se limita a la purificación de productos recombinantes. [0010] La invención se refiere a la formulación de anticuerpo preparada por el procedimiento y a usos para esta formulación de anticuerpo. En particular, tal como se muestra en las reivindicaciones, la invención aporta un anticuerpo que comprende un fragmento de cadena pesada VH-CH1-VH-CH1 lineal asociado con dos fragmentos de cadena ligera, donde el extremo C-terminal de CH1 está unido directamente, sin ninguna secuencia de proteína de unión externa, al extremo N-terminal de VH en la unión Fd-Fd del fragmento de la cadena pesada; un ácido nucleico que codifica por el fragmento de cadena pesada; y un método para la preparación de dicho anticuerpo. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS [0011] ES 2 365 929 T3 La Fig.1 muestra un típico flujo a través del cromatograma de cromatografía de interacción hidrofóbica de pH bajo (ver ejemplo 1). La columna era operativa en el modo de flujo continuo. El fragmento de anticuerpo plegado correctamente, unido a disulfuro circula a través de ella. La cadena ligera, la cadena pesada, los agregados ligeros-pesados y las especies de fragmentos de anticuerpo no ligados a disulfuro quedan pegados a la columna. El pico 1 es el flujo continuo después de un lavado con agua, el pico 2 es el lavado con urea de las especies unidas. La Fig.... [Seguir leyendo]

ES 2 365 929 T3 1. Anticuerpo que comprende un fragmento de cadena pesada VH-CH1-VH-CH1 lineal asociado con dos fragmentos de cadena ligera, donde el extremo C-terminal de CH1 está unido directamente, sin ninguna secuencia de proteína de unión externa, al extremo N-terminal de VH en la unión Fd-Fd del fragmento de la cadena pesada. 2. Anticuerpo según la reivindicación 1, donde los dominios VH son idénticos. 3. Ácido nucleico aislado que codifica por un fragmento de cadena pesada VH-CH1-VH-CH1 de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2. 4. Método para preparar el fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1 ó 2, que comprende cultivar una célula huésped que comprende ácido nucleico que codifica el fragmento de la cadena pesada y un fragmento de cadena ligera de tal forma que el ácido nucleico se exprese; y recuperar el fragmento de anticuerpo del cultivo de células huésped. 23 ES 2 365 929 T3 24 ES 2 365 929 T3 ES 2 365 929 T3 26 ES 2 365 929 T3 27 ES 2 365 929 T3 28 ES 2 365 929 T3 29 ES 2 365 929 T3 ES 2 365 929 T3 31 ES 2 365 929 T3 32 REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN 5 Esta lista de referencias citadas por el solicitante es únicamente para la comodidad del lector. No forma parte del documento de la patente europea. A pesar del cuidado tenido en la recopilación de las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO niega toda responsabilidad en este sentido. Documentos de patentes citados en la descripción U.S. 4,816,567. EP 404,097. WO 93/11161. 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