FLAVENOIDE METILTRANSFERASA A PARTIR DE LA TORENIA Y SUS USOS.

Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos codificante o complementaria a una secuencia que codifica un flavonoide metiltransferasa (FMT),

en donde dicha secuencia de nucleótidos comprende: (i) una secuencia de nucleótidos enunciada en SEQ ID NO:11; (ii) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 70% de identidad después de la alineación óptima con SEQ ID NO:11; (iii) una secuencia de nucleótidos capaz de hibridizar bajo condiciones de alto rigor con SEQ ID NO:11 o su forma complementaria; (iv) una secuencia de nucleótidos capaz de codificar la secuencia de aminoácidos enunciada en SEQ ID NO:12; (v) una secuencia de nucleótidos capaz de codificar una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70% de identidad después de la alineación óptima con SEQ ID NO:12; (vi) una secuencia de nucleótidos capaz de hibridizar bajo condiciones de alto rigor con la secuencia de nucleótidos en (iv) o (v) o su forma complementaria

Antecedentes de la invención

Campo de la invención

ºº La presente invención se refiere a una secuencia genética que codifica un polipéptido que tiene actividad de metiltransferasa y el uso de la secuencia genética y/o el polipéptido para modificar una o más características fenotípicas de una planta. La metiltransferasa de la presente invención actúa sobre los flavonoides, preferiblemente cuando el flavonoide es una antocianina. Más particularmente, la presente invención se refiere a un polipéptido que tiene actividad s-adenosil-l-metionina: antocianina 3' -o-metiltransferasa o s-adenosil-l-metionina: antocianina 3', 5'-o-

ººº metiltransferasa. La presente invención se refiere aún más a una secuencia genética que codifica un polipéptido que tiene actividad de metiltransferasa, derivada de torenia. Las moléculas antisentido y sentido correspondientes a toda o parte de la secuencia genética sujeto, se describen así como plantas genéticamente modificadas así como flores cortadas, partes, extractos y tejido reproductivo de dichas plantas.

Descripción de la técnica anterior

ººº Los detalles bibliográficos de las publicaciones mencionadas por el autor en esta especificación se recolectan en el final de la descripción.

La referencia a cualquier técnica anterior en esta especificación no es, y no debe ser tomada como, una aceptación o cualquier forma de sugerencia de que esta técnica anterior forma parte del conocimiento general común en cualquier país.

ººº La industria de las flores o las plantas ornamentales se esfuerza por desarrollar nuevas y diferentes variedades de flores y/o plantas. Una forma efectiva de crear dichas variedades novedosas es a través de la manipulación del color de la flor. Las técnicas clásicas de reproducción han sido utilizadas con cierto éxito para producir un amplio rango de colores para la mayoría de las variedades comerciales de flores y/o plantas disponibles en la actualidad. Este enfoque ha sido limitado, sin embargo, por las limitaciones de la reserva genética de una especie particular y por esta razón, es

ººº raro que una única especie tenga el espectro completo de variedades de color. Por ejemplo, el desarrollo de novedosas variedades de color de las plantas o partes de las plantas tales como flores, hojas y tallos debería ofrecer una oportunidad significante en ambos los mercados de flores de corte y ornamentales. En la industria de flores o plantas ornamentales, el desarrollo de novedosas variedades de color de las principales especies de flores tales como rosas, crisantemos, tulipanes, lirios, claveles, gérberas, orquídeas, lisianthus, begonias, torenia, geranios, petunias,

ººº nierembergia, pelargonium, impatiens y ciclamino sería de gran interés. Un ejemplo más específico sería el desarrollo de una rosa o gérbera azul para el mercado de la flor de corte.

Además, el desarrollo de novedosas variedades de color de partes de plantas tales como vegetales, frutas y semillas debería ofrecer significantes oportunidades en la agricultura. Por ejemplo, novedosas semillas de color deberían ser útiles como etiquetas de propiedad para las plantas. Adicionalmente, las modificaciones a los flavonoides comunes a

ººº las bayas incluyendo uvas y sus jugos incluyendo el vino, tienen el potencial para impartir características de estilo alterado de valor a dicha fruta y la industria de subproductos.

El color de la flor se debe predominantemente a tres tipos de pigmentos: flavonoides, carotenoides y betalaínas. De los tres, los flavonoides son los más comunes y aportan un rango de colores de amarillo a rojo a azul. Las moléculas de flavonoides que hacen la mayor contribución al color de la flor son las antocianinas, que son derivados glucosilados de

ººº la cianidina y su derivado metilado peonidina, delfinidina y sus derivados metilados petunidina y malvidina y pelargonidina. Las antocianinas se localizan en la vacuola de las células epidérmicas de los pétalos o vacuola de células sub-epidérmicas de las hojas.

Los pigmentos de flavonoides son metabolitos secundarios de la ruta fenilpropanoide. La ruta biosintética de los pigmentos de flavonoides (ruta flavonoide) se establece bien, (Holton and Cornish, Planta Cell 7: 1071-1083;. 1995; Mol et al., Trends Planta Sci. 3: 212-217, 1998; Winkel-Shirley, Planta Physiol. 126: 485-493, 2001 a) y Winkel-Shirley, Planta Physiol. 127: 1399-1404, 2001 b) y se muestran en las Figuras 1A y B. Tres reacciones y enzimas se involucran en la conversión de la fenilalanina a p-coumaroil-CoA, uno de los primeros sustratos clave en las rutas flavonoides. Las enzimas son fenilalanina amonio- liasa (PAL), cinamato 4-hidroxilasa (C4H) y 4-coumarato: CoA ligasa (4CL). La

ºº primera etapa comprometida en la ruta involucra la condensación de tres moléculas de malonil-CoA (proporcionada por la acción de la acetil CoA carboxilasa (ACC) sobre la acetil CoA y CO2) con una molécula de p-coumaroil-CoA. Esta reacción se cataliza por la enzima chalcona sintasa (CHS). El producto de esta reacción, 2',4,4',6', tetrahidroxichalcona, normalmente se isomeriza rápidamente por la enzima chalcona flavanona isomerasa (CHI) para producir la naringenina. La naringenina posteriormente se hidroxila en la posición 3 del anillo central por la flavanona 3-hidroxilasa

ººº (F3H) para producir dihidrocampferol (DHK).

El anillo-B de DHK puede ser hidroxilado, ya sea, en la posición 3', o ambas posiciones 3' y 5', para producir la dihidroquercetina (DHQ) y dihidromiricetina (DHM), respectivamente. El patrón de hidroxilación del anillo-B juega un papel clave en la determinación del color del pétalo, con DHK por lo general conduce a la producción de los pigmentos basados en pelargonidina rojo ladrillo, DHQ por lo general conduce a los pigmentos basados en cianidina rosa/rojo y

ººº DHM por lo general conduce a los pigmentos basados en delfinidina azul/violeta.

Los dihidroflavonoles (DHK, DHQ y DHM) también pueden actuar por flavonol sintasa para producir los flavonoles campferol, quercetina y miricetina. Los flavonoles son incoloros pero actúan como copigmentos con las antocianinas para realzar el color de la flor.

La siguiente etapa en la ruta, conduce a la producción de las antocianinas de color a partir de los dihidroflavonoles,

ººº involucra el dihidroflavonol 4-reductasa (DFR) con la producción de las leucoantocianidinas. Estas moléculas de flavonoides son inestables bajo condiciones fisiológicas normales y la glicosilación en la posición-3, a través de la acción de glicosiltransferasas, estabiliza la molécula antocianidina permitiendo así la acumulación de las antocianinas. En general, las glicosiltransferasas transfieren las fracciones de azúcar a partir de azúcares UDP y muestran altas especificidades para la posición de la glicosilación y relativamente bajas especificidades para los sustratos aceptor

ººº (Seitz and Hinderer, Anthocyanins. In: Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants. Constabel, F. and Vasil, I.K. (eds.), Academic Press, New York, USA, 5: 49-76, 1988). Las antocianinas pueden ocurrir como 3-monosidos, 3biosidos y 3-triosidos así como 3, 5-diglicósidos y 3, 7-diglicósidos asociados con los azúcares glucosa, galactosa, ramnosa, arabinosa y xilosa (Strack and Wray, In: The Flavonoids - Advances in Research since 1986. Harbome, J.B. (ed), Chapman and Hall, London, UK, 1-22,1993).

ººº Las glicosiltransferasas implicadas en la estabilización de la molécula antocianidina incluyen UDP glucosa: flavonoide 3-glucosiltransferasa (3GT), que transfiere una fracción glucosa de la UDP glucosa con la 3-O-posición de la molécula antocianidina para producir el antocianidina 3-O-glucósido.

En las petunias y pensamientos (entre otros), estas antocianinas luego se pueden glicosilar por otra glicosiltransferasa, UDP ramnosa: antocianidina 3-glucósido ramnosiltransferasa (3RT), cuyos ácidos un grupo ramnosa con la glucosa-O

ººº 3-unida de la molécula de antocianina para producir la antocianidina 3-rutinosidos, y una vez acilado, se puede además modificar por la UDP: glucosa antocianina 5 glucosiltransferasa (5GT).

Muchos glucósidos de la antocianidina existen en la forma de derivados poliacetilados. La acilación puede ser importante para la reabsorción de antocianinas en las vacuolas como fue demostrado por Hopp and Seitz (Planta 170: 74-85, 1987). Los grupos acil que modifican los glucósidos de la antocianidina pueden ser divididos en dos principales

ººº clases basándose en su estructura. Los grupos acil alifáticos incluyen ácido malónico o ácido succínico y la clase aromática incluye los ácidos hidroxil cinámicos... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos codificante o complementaria a una secuencia que codifica un flavonoide metiltransferasa (FMT), en donde dicha secuencia de nucleótidos comprende:

ºº (i) una secuencia de nucleótidos enunciada en SEQ ID NO:11;

(ii) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 70% de identidad después de la alineación óptima con SEQ ID NO:11;

(iii) una secuencia de nucleótidos capaz de hibridizar bajo condiciones de alto rigor con SEQ ID NO:11 o su forma complementaria;

ººº (iv) una secuencia de nucleótidos capaz de codificar la secuencia de aminoácidos enunciada en SEQ ID NO:12;

(v) una secuencia de nucleótidos capaz de codificar una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70% de identidad después de la alineación óptima con SEQ ID NO:12;

(vi) una secuencia de nucleótidos capaz de hibridizar bajo condiciones de alto rigor con la secuencia de nucleótidos en

(iv) o (v) o su forma complementaria.

ººº 2. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1, en donde la FMT modula o por otra parte facilita la metilación de una antocianina.

3. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1 o 2, en donde la FMT es una S-adenosil-L-metionina-Ometiltransferasa (SAM-OMTs) de Clase I.

4. La molécula de ácido nucleico aislada de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la FMT es una 3'FMT o

ººº 3'S'FMT.

5. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 2, en donde la molécula de antocianina es un derivado de delfinidina o un derivado de petunidina o cianidina.

6. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 2 o 5, en donde la molécula de antocianina es la delfinidina 3-glucósido, delfinidina 3, 5-diglucósido o delfinidina 3-rutinósido.

ººº 7. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 2, en donde la metilación de una molécula de antocianina da lugar a la producción de un derivado de petunidina, malvidina o peonidina.

8. La molécula de ácido nucleico aislada de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la molécula es de origen Torenia.

9. Una construcción genética que comprende una molécula de ácido nucleico, como se define en cualquiera de las

ººº reivindicaciones 1 a 8.

10. Una planta modificada genéticamente o parte de esta o células de la misma que comprende una molécula de ácido nucleico no-indígena como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

11. La planta modificada genéticamente o parte de esta o las células de la misma de la reivindicación 10, en donde dicha planta o parte de esta o las células de la misma es a partir de una especie de flor cortada, una especie de planta

ººº de horticultura o una especie de planta de agricultura.

12. La planta modificada genéticamente o parte de esta o las células de la misma de la reivindicación 11, en donde la planta de horticultura o agricultura muestra flores o inflorescencia alteradas.

13. La planta modificada genéticamente o parte de esta o las células de la misma de la reivindicación 11 o 12 en donde dicha parte modificada es un sépalo, bráctea, pecíolo, pedúnculo, ovario, antera, tallo, hojas, raíces, flor, semilla, fruta, nuez, bayas o vegetales.

14. La planta modificada genéticamente o parte de esta o las células de la misma de cualquiera de las reivindicaciones

ºº 11 a 13, en donde la planta se selecciona de una rosa, claveles, lisianthus, petunia, lirio, pensamiento, gérberas, crisantemos, Torenia, Begonia, Cyclamen, Nierembergia, Cathoranthus, Pelargonium, Orchid, uva, Euphorbia o Fuchsia.

15. Las flores cortadas o separadas de una planta de cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14.

16. La progenie, la descendencia de progenie o líneas propagadas de manera vegetativa de la planta modificada

ººº genéticamente de cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, en donde dicha progenie, la descendencia de progenie o líneas propagadas de manera vegetativa comprenden una molécula de ácido nucleico no-indígena como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

17. Un método para producir una planta modificada genéticamente capaz de sintetizar una FMT, o con una actividad de FMT indígena, reducida o existente, dicho método que comprende:

ººº (a) con el fin de producir una planta capaz de sintetizar FMT, transformar establemente una célula de una planta apropiada con una molécula de ácido nucleico bajo condiciones que permiten la expresión eventual, de dicha secuencia de ácido nucleico, regenerar una planta transgénica a partir de la célula y el cultivo de dicha planta transgénica durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para permitir la expresión de la secuencia de ácido nucleico;

ººº (b) con el fin de, producir una planta con actividad de FMT existente o indígena reducida, transformar establemente una célula de una planta apropiada con una molécula de ácido nucleico, regenerar una planta transgénica a partir de la célula y cuando sea necesario, cultivar dicha planta transgénica bajo condiciones suficientes para permitir la expresión del ácido nucleico; o

(c) con el fin de producir una planta con actividad de FMT existente o indígena reducida, alterar una gen codificante de

ººº FMT a través de una modificación de las secuencias indígenas vía recombinación homóloga de un ácido nucleico alterado de forma apropiada, introducido en la célula de la planta, y regenerar la planta modificada genéticamente a partir de la célula; en donde dicho ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos, como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

18. Un método para producir una planta modificada genéticamente con niveles alterados de FMT codificados en una

ººº molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, dicho método que comprende introducir en una célula o células de dicha planta una secuencia genética seleccionada de:

(i) una secuencia antisentido para un ARNm de FMT;

(ii) una secuencia sentido para un ADN de FMT; y/o

(iii) una secuencia que induce ARNi específica para un ARNm de FMT;

ººº y regenerar una planta modificada genéticamente a partir de dicha célula.

19. Un método para producir una planta transgénica capaz de expresar un gen codificante recombinante de una FMT o parte de esta o que lleva una secuencia de ácido nucleico que es sustancialmente complementaria a toda o una parte de una molécula de ARNm opcionalmente transcribible, cuando sea necesario, para realizar la regulación de una FMT, dicho método que comprende transformar establemente una célula de una planta apropiada con la molécula de ácido

ººº nucleico aislada, como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, cuando sea necesario, bajo condiciones que permiten la expresión eventual de dicha molécula de ácido nucleico aislada, y regenerar una planta transgénica a partir de la célula.

20. El método de cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, en donde la planta muestra una inflorescencia modificada.

21. Una secuencia de oligonucleótidos aislada enunciada en SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:32 o SEQ ID NO:33.

22. Una FMT recombinante aislada codificada por una molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones

ºº 1 a 8.

23. La FMT recombinante de la reivindicación 22, en donde la FMT recombinante es una molécula de fusión que comprende dos o más secuencias de aminoácidos heterólogas.

24. Una molécula de ácido nucleico de FMT recombinante aislada de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende una fusión de dos o más secuencias de nucleótidos heterólogas.

ººº 25. Un organismo procariota o eucariota que lleva una secuencia genética que codifica una molécula de FMT de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, de manera extracromosomal en forma de plásmido.

26. Uso de una molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la fabricación de una planta modificada genéticamente.

27. Uso de la reivindicación 26, en donde la planta modificada genéticamente muestra flores o inflorescencia alteradas.