Una proteína FVIII activa procoagulante que comprende un polipéptido FVIII humano que es modificado,

en el que la modificación comprende una deleción del dominio B, una deleción del sitio de unión del factor de von Willebrand, una mutación en Phe309, una mutación en Arg740 y una adición de un espaciador de secuencia de aminoácido entre los dominios A2 y A3

Campo de la invención

La presente invención se refiere a las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones. Por lo tanto, se refiere a una proteína FVIII procoagulante activa que comprende un polipéptido FVIII humano que está modificado, en el que la modificación comprende una deleción del dominio B, una deleción del factor de unión del sitio de unión de von Willebrand, una mutación en Phe309, una mutación en Arg740 y una adición de un espaciador de la secuencia de aminoácidos entre los dominios A2 y A3.

Antecedentes de la invención

El factor humano VIll:C (el FVIII) es un factor de coagulación deficiente en el trastorno de sangrado relacionado con el cromosoma X, hemofilia A, causa principal de la morbosidad hemorrágica y de la mortalidad en los varones afectados. Tradicionalmente, a los hemofílicos se les ha tratado con transfusiones de sangre entera. Más recientemente, el tratamiento se viene realizando con preparaciones de concentrados de FVIII derivados de plasma humano. Sin embargo, el uso de productos derivados de plasma expone a los pacientes hemofílicos a un posible riesgo de enfermedades transmisibles por virus, tales como la hepatitis y el SIDA. Los costosos programas de purificación que reducen este riesgo aumentan los gastos de tratamiento. Con los aumentos de los gastos y la limitada disponibilidad del FVIII derivado del plasma, a los pacientes se les trata episódicamente según la demanda, en vez de profilácticamente. El FVIII recombinantemente producido tiene ventajas importantes respecto al FVIII derivado del plasma en términos de pureza y seguridad, así como una mayor disponibilidad y en consecuencia, se ha dirigido mucho esfuerzo en la investigación para el desarrollo del FVIII producido recombinantemente. Debido a la naturaleza lábil del FVIII, sobre todo después de su activación, se deben administrar grandes dosis y repetidas de la proteína o del plasma o del derivado recombinante, para conseguir una ventaja terapéutica. Sin embargo, la cantidad de proteína FVIII a la cual el paciente se expone se ha correlacionado con el desarrollo de anticuerpos que inhiben su actividad, a la luz de la conocida inmunogenicidad, uno de los objetivos en el desarrollo de nuevas formas recombinantes de FVIII para su uso como agente terapéutico es el desarrollo de productos que reduzcan o eliminen dicha respuesta inmune.

El FVIII funciona en la ruta intrínseca de la coagulación de la sangre como un cofactor que acelera la activación del factor X por el factor IXa, una reacción que ocurre en la superficie fosfolipídica cargada negativamente en presencia de iones de calcio. El FVIII se sintetiza como un polipéptido de cadena sencilla de 2351 aminoácidos que tiene la estructura del dominio A1-A2-B-A3-C1-C2. Wehar. G.A. et al..; Nature 312:337-342 (1984) y Toole, J.J. et al.; Nature 312:342-347 (1984). La estructura del dominio de FVIII es idéntica a la del factor de coagulación homólogo, el factor V (FV). Kane, W.H. et al.; PNAS (USA) 83:6800-6804 (1986) y Jenny, R.J. et al.; PNAS (USA) 84:4846-4850 (1987). Los dominios A de FVIII tienen 330 aminoácidos y una identidad de aminoácidos del 40 % entre sí y el dominio A de FV y la proteína del plasma que se une al cobre de la ceruloplasmina. Takahashi. N. et al.; PNAS (USA) 81:390-394 (1984). Cada dominio C tiene 150 aminoácidos y muestra una identidad del 40 % respecto a los dominios C de FV, y respecto a las proteínas que se unen a glicoconjugados y fosfolípidos negativamente cargados. Stubbs, J.D. et al., PNAS (USA) 87:8417-8421 (1990). El dominio B de FVIII está codificado por un solo exón y muestra poca homología con cualquier proteína conocida incluyendo el dominio B de FV. Gitschier. J. et al.; Nature 312:326-330 (1984) y Cripe, L.D. et al.; Biochemistry 31:3777-3785 (1992).

El FVIII se secreta en el plasma como un heterodímero de una cadena pesada (dominios A1-A2-B) y una cadena ligera (dominios A3-C1-C2) asociada a través de un enlace de ión metálico divalente no covalente entre los dominios A1 y A3, en el plasma, El FVIII se estabiliza uniéndose al factor de von Willebrand. Más específicamente, la cadena ligera de FVIII se une por interacciones no covalentes a un sitio de unión primario en el extremo amino del factor de von Willebrand. Con la activación proteolítica por la trombina, el FVIII se activa en un heterotrímero de 2 fragmentos de la cadena pesada (A1, un fragmento de 50 kDa, y A2, un fragmento de 43 kDa) y la cadena ligera (A3-C1-C2, una cadena de 73 kDa). La forma activa del FVIII (FVIIla) consiste así en una subunidad A1 asociada a través de la unión del ión metálico divalente a una cadena ligera de A3-C1-C2 dividida de trombina y una subunidad A2 libre asociada con el dominio A1 a través de una asociación iónica (véase la Figura 1A). Eaton. D. et al.; Biochemistry 25: 505 (1986); Lollar, P. et al.; J. Biol. Chem. 266: 12481 (1991); y Fay, P.J. et al., J. Biol. Chem. 266: 8957 (1991). Este heterotrímero de FVIIla es inestable y está sometido a la rápida inactivación a través de la disociación de la subunidad A2 en condiciones fisiológicas.

Estudios de transfección anteriores han demostrado que el FVIII es secretado 10 veces menos eficazmente que el FV. La secreción ineficaz de FVIII se correlaciona con la unión a la proteína chaperonina identificada como la proteína de unión de la inmunoglobulina (BiP), también conocida como la proteína regulada por la glucosa de 78 kDa (GRP78) (Munro, S. et al., Cell 46:291-300 (1986)) dentro del lumen del RE (Domer. A. J. et al.; EMBO J. 4:15631571 (1992)). La BiP es un elemento de la familia de la proteína de choque térmico que muestra una actividad de ATPasa dependiente de péptido. Flynn, G.C. et al., Science 245:385-390 (1989). La expresión de BiP es inducida por la presencia de proteínas desplegadas o subunidades de proteína no ensambladas dentro del RE. Lee, A.S., Curr Opin. Cell Biol. 4:267-273 (1992) y Kozutsumi, Y. et al.; Nature 332:462-464 (1988). Se ha demostrado que el alto nivel de expresión de FVIII induce la transcripción de BiP. Domer, A.J. et al., J. Biol. Chem. 264:20502-20607 (1989). Además, la liberación de FVIII desde BiP y el transporte desde el RE requiere niveles altos de ATP intracelular. Domer, A.J. et al., PNAS (USA) 87:7429-7432 (1990), en contraste, se ha encontrado que FV no se asocia con BiP y no requiere niveles altos de ATP para la secreción. Pittman, D.D. et al., J. Biol. Chem. 269: 1732917337 (1994). La deleción del dominio B de FVIII proporcionó una proteína que se unía a BIP en un grado menor y se secretaba más eficazmente. Domer, A.J. et al.; J. Cell Biol. 105:2655-2674 (1987). Para evaluar si el dominio B de FVIII era responsable de la interacción de BiP, fueron construidas moléculas de cDNA quiméricas de FV y FVIII en las que fueron cambiadas las secuencias del dominio B. Pittman. D.D. et al.; Blood 84:4214-4225 (1994). Un híbrido de FVIII que alberga al dominio B de FV fue expresado y secretado como una molécula funcional, aunque la eficacia de secreción del híbrido era pobre, similar al FVIII tipo silvestre. Pittman, D.D. et al. Blood 84:4214-4225 (1994). Esto indicaba que la diferencia en la eficacia de secreción entre FV y FVIII no era directamente atribuible a secuencias específicas dentro del dominio B de FVIII, la región más divergente entre estos factores de coagulación homólogos.

Para determinar si las secuencias de aminoácidos específicas dentro de la secreción de inhibición del dominio A de FVIII, fueron estudiadas proteínas quiméricas que contenían los dominios A1 y A2 de FVIII o FV. La proteína quimérica que contiene los dominios A1 y A2 del FV fue secretada con una eficacia similar como el FV tipo silvestre. La quimera complementaria que tiene los dominios A1 y A2 del FVIII fue secretada con una eficacia baja similar a la del FVIII tipo silvestre. Estos resultados sugirieron que las secuencias dentro de los dominios A1 y A2 fueron responsables de una eficacia de secreción baja de FVIII. Una molécula de FVIll con el dominio A1 delecionado fue construida y la secreción fue aumentada aproximadamente 10 veces comparado con el FVIII delecionado del dominio A2 del FVIII tipo silvestre. La expresión del dominio A1 de FVIII solo no proporcionó la proteína secretada, mientras que la expresión del dominio A2 de FVIII solo o el dominio A1 de FV o el dominio A2 solo dirigía la síntesis de la proteína secretada. La secreción de un híbrido en el cual los 110 aminoácidos del extremo carboxilo-terminal del dominio A1 fueron sustituidos por secuencias homólogas del dominio A1 de FV (226-336 híbrido FVIII) también fue aumentada 10 veces comparado con el FVIII tipo silvestre, sin embargo, la proteína secretada no... [Seguir leyendo]

1. Una proteína FVIII activa procoagulante que comprende un polipéptido FVIII humano que es modificado, en el que la modificación comprende una deleción del dominio B, una deleción del sitio de unión del factor de von Willebrand, una mutación en Phe309, una mutación en Arg740 y una adición de un espaciador de secuencia de aminoácido entre los dominios A2 y A3.

2. La proteína de la reivindicación 1, en la que la modificación comprende además una sustitución del residuo Arg en la posición 336 con Ile y una sustitución del residuo Arg en la posición 562 con Lys.

3. La proteína de la reivindicación 1 o 2, en el que la mutación comprende una sustitución de Arg en la posición 740 con Ala.

4. La proteína de cualquiera de reivindicaciones 1 a 3, en la que el espaciador de la secuencia de aminoácidos tiene 54 residuos de longitud.

5. La proteína de la reivindicación 4, en la que el espaciador de la secuencia de aminoácidos comprende los residuos de 741 a 794 del FVIII tipo silvestre, en el que el residuo en la posición 794 es treonina o leucina.

6. Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de la reivindicación 1.

7. Un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 6.

8. Una célula huésped transformada o transfectada con la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 6 o el vector de expresión de la reivindicación 7.

9. Un método para la producción de una proteína activa procoagulante que comprende las etapas de:

a) hacer crecer en un cultivo una célula huésped transformada o transfectada con la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 6; y

b) aislar a partir de la célula huésped y del cultivo, el producto polipeptídico de la expresión de la molécula de ácido nucleico.

10. Una composición farmacéutica que comprende la proteína de la reivindicación 1 junto con un vehículo o excipiente parenteralmente aceptable.

11. El uso de una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 6 de la preparación de una composición farmacéutica para uso en terapia génica.

12. Un método para aumentar la unión de la proteína de la reivindicación 1 al factor de von Willebrand que comprende la etapa de combinar un anticuerpo contra la cadena ligera del heterodímero FVIII con la proteína de la reivindicación 1 que aumenta la afinidad de unión de la proteína respecto al factor de von Willebrand.

13. El método de la reivindicación 12, en el que el anticuerpo reconoce un epítopo en los aminoácidos 2248 a 2285 de la proteína.

14. El método de la reivindicación 13, en el que el anticuerpo es ESH8.