Un método para producir polipéptido recombinante biológicamente activo en un cultivo de plantas de lenteja de agua o un cultivo de nódulos de lenteja de agua,

que comprende las etapas de: (a) cultivar dentro de un medio de cultivo para lentejas de agua un cultivo de plantas de lenteja de agua o un cultivo de nódulos de lenteja de agua, en donde dicho cultivo de plantas de lenteja de agua o dicho cultivo de nódulos de lenteja de agua se transforma establemente para expresar dicho polipéptido recombinante biológicamente activo, y en donde dicho polipéptido recombinante biológicamente activo se expresa a partir de una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia codificadora para dicho polipéptido recombinante y una secuencia codificadora conectada operativamente para un péptido de señal que dirige la secreción del polipéptido recombinante; y (b) recoger dicho polipéptido recombinante del medio de cultivo para lentejas de agua; en el que dicha secuencia de péptido de señal se selecciona de: (a) el péptido de señal de interferón α-2b humano; (b) el péptido de señal de quitinasa de Arabidopsis thaliana; (c) el péptido de señal de α-amilasa de arroz; y (d) el péptido de α-amilasa de arroz modificado indicado en el Nº ID SEC: 7

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a métodos y composiciones para la expresión y la secreción de polipéptidos biológicamente activos procedentes de lenteja de agua manipulada genéticament.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las lentejas de agua son los únicos miembros de la familia de monocotiledóneas Lemnaceae. Los cuatro géneros y las 34 especies son pequeñas plantas de agua dulce que flotan libremente cuyo ámbito geográfico se extiende por todo el mundo (Landolt (1986) Biosystematic Investigation on the Family of Duckweeds: The Family of Lemnaceae A Monograph Study Geobatanischen Institut ETH, Stiftung Rubel, Zurich). Aunque son las plantas más reducidas morfológicamente conocidas, la mayoría de las especies de lenteja de agua tiene todos los tejidos y órganos de plantas mucho mayores, incluyendo raíces, tallos, flores, semillas y frondas. Las especies de lenteja de agua se han estudiado intensivamente y existe una bibliografía sustancial que detalla su ecología, sistemática, ciclo vital, metabolismo, propensión a enfermedades y plagas, su biología reproductiva, estructura genética y biología celular. (Hillman (1961) Bot. Review 27: 221; Landolt (1986) Biosystematic Investigation on the Family of Duckweeds: The Family of Lemnaceae-A Monograph Study Geobatanischen Institut ETH, Stiftung Rubel, Zurich).

El hábito de crecimiento de las lentejas de agua es ideal para métodos de cultivo microbiano. La planta prolifera rápidamente a través de la brotación vegetativa de nuevas frondas, de un modo macroscópico análogo a la propagación asexual en la levadura. Esta proliferación se produce mediante brotación vegetativa a partir de células meristemáticas. La región meristemática es pequeña y se encuentra en la superficie ventral de la fronda. Las células meristemáticas están en dos sacos, uno en cada lado del nervio central de la fronda. La pequeña región del nervio central también es el lugar a partir del cual se origina la raíz y surge el tallo que conecta cada fronda con su fronda madre. El saco meristemático está protegido por una aleta de tejido. Las frondas brotan alternativamente de estos sacos. Los tiempos de doblamiento varían según la especie y son tan cortos como 20-24 horas (Landolt (1957) Ber. Schweiz. Bot. Ges. 67: 271; Chang et ál. (1977) Bull. Inst. Chem. Acad. Sin. 24:19; Datko y Mudd (1970) Plant Physiol. 65:16; Venkataraman et ál. (1970) Z. Pflanzenphysiol.

62: 316).

El cultivo intensivo de lenteja de agua da como resultado los grados más altos de acumulación de biomasa por unidad de tiempo (Landolt y Kandeler (1987) The Family of Lemnaceae-A Monographic Study Vol. 2: Phytochemistry, Physiology, Application, Bibliography, Veroffentlichungen des Geobotanischen Institutes ETH, Stiftung Rubel, Zurich), con una acumulación en peso seco de 6-15% de peso fresco (Tillberg et ál. (1979) Physiol. Plant. 46:5; Landolt (1957) Ber. Schweiz. Bot. Ges. 67:271; Stomp, datos no publicados). Se ha presentado que el contenido de proteína de un número de especies de lenteja de agua desarrolladas bajo condiciones variables varía de 15-45% en peso seco (Chang et al (1977) Bull. Inst. Chem. Acad Sin. 24:19; Chang y Chui (1978) Z. Pflanzenphysiol. 89:91; Porath et ál. (1979) Aquatic Botany 7:272; Appenroth et ál. (1982) Biochem. Physiol. Pflanz. 177:251). Usando estos valores, el nivel de producción de proteína por litro de medio en lenteja de agua es del mismo orden de magnitud que sistemas de expresión génica de levadura.

La reproducción sexual en la lenteja de agua está controlada por los componentes del medio y las condiciones de cultivo, incluyendo el fotoperíodo y la densidad de cultivo. La inducción de las flores es un procedimiento de laboratorio habitual con algunas especies. Las plantas normalmente se autopolinizan, y la autofecundación puede conseguirse en el laboratorio mediante cultivos que se baten suavemente. Mediante este método, se han desarrollado líneas consanguíneas de Lemna gibba. Se han identificado mutaciones espontáneas (Slovin y Cohen (1988) Plant Physiol. 86, 522), y se ha usado mutagénesis química y por rayos gamma (usando EMS o NMU) para producir mutantes con características definidas. La fecundación cruzada de L. gibba es tediosa pero puede realizarse mediante polinización manual controlada. El tamaño del genoma de las lentejas de agua varía de 0,25-1,63 pg de DNA/2C con conteos cromosómicos que varían de 20 a 80 y que promedian aproximadamente 40 a través de las Lemnaceae (Landolt (1986) Biosystematic Investigation on the Family of Duckweeds: The family of Lemnaceae-A Monograph Study Geobatanischen Institut ETH, Stiftung Rubel, Zurich). Se estima que los niveles de ploidía varían de 2-12

C. Id. La diversidad genética de las Lemnaceae se ha investigado usando productos secundarios, isozimas y secuencias de DNA (McClure y Alston (1966) Nature 4916:311; McClure y Alston (1966) Amer. J. Bot. 53:849; Vasseur et ál. (1991) Pl. Syst. Evol. 177:139 (1991); Crawford y Landolt (1993) Syst. Bot. 10:389).

Cultivos de plantas de lenteja de agua o nódulos de lenteja de agua pueden transformarse eficazmente con un casete de expresión que contiene una secuencia de nucleótidos de interés mediante un número de métodos, incluyendo transferencia génica mediada por Agrobacterium, bombardeo balístico o electroporación. Transformantes de lenteja de agua estables pueden aislarse transformando las células de lenteja de agua tanto con la secuencia de nucleótidos de interés como con un gen que confiere resistencia un agente de selección, seguido por cultivo de las células transformadas en un medio que contiene el agente de selección. Véase la Patente de EE. UU. Nº 6.040.498 y WO 99/07210 de Stomp et ál.

Un sistema de expresión génica de lenteja de agua proporciona la tecnología esencial que sería útil para un número de aplicaciones de investigación y comerciales. Para la investigación de la biología molecular de las plantas como un todo, un sistema de plantas diferenciadas que puede manipularse con la comodidad de laboratorio de la levadura proporciona un sistema muy rápido en el que analizar los papeles de desarrollo y fisiológicos de genes aislados. Para la producción comercial de polipéptidos valiosos, un sistema basado en lenteja de agua tiene un número de ventajas sobre los sistemas microbianos o de cultivo celular existentes. Las plantas demuestran un procesamiento postraduccional que es similar a las células de mamífero, venciendo un problema principal asociado con la producción de células microbianas de los polipéptidos de mamífero biológicamente activos, y ha sido mostrado por otros (Hiatt (1990) Nature 334:469) que los sistemas vegetales tienen la capacidad de montar proteínas multisubunitarias, una capacidad a menudo ausente en los sistemas microbianos. El aumento a escala de biomasa de lenteja de agua hasta niveles necesarios para la producción comercial de proteínas recombinantes es más rápido y más económico que el aumento a escala similar de células de mamífero, y, a diferencia de otros sistemas de producción de plantas sugeridos, p. ej. habas de soja y tabaco, la lenteja de agua puede hacerse crecer en recipientes de producción de biomasa completamente contenidos y controlados, haciendo mucho más fácil la integración del sistema en una infraestructura industrial de producción de proteínas existente.

Estas características hacen a la lenteja de agua una elección ideal para desarrollar como un sistema basado en plantas eficaz para la producción de proteínas recombinantes. De acuerdo con esto, la presente invención proporciona métodos y composiciones para incrementar la eficacia del sistema de expresión génica de lenteja de agua como una herramienta para producir polipéptidos biológicamente activos. SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se dirige a métodos para la expresión y la recuperación de polipéptidos recombinantes biológicamente activos, usando lenteja de agua como el sistema de expresión. Un aspecto de la presente invención proporciona un método para niveles de expresión mejorados de polipéptidos biológicamente activos en lenteja de agua, dando como resultado un rendimiento de polipéptido incrementado y permitiendo la producción de cantidades útiles de polipéptidos biológicamente activos valiosos en este sistema. Otro aspecto de la invención divulga métodos para la secreción dirigida de polipéptidos biológicamente activos a partir de cultivos de planta de lenteja de agua o nódulos de lenteja de agua manipulados genéticamente. La secreción del polipéptido expresado...

1. Un método para producir polipéptido recombinante biológicamente activo en un cultivo de plantas de lenteja de agua o un cultivo de nódulos de lenteja de agua, que comprende las etapas de:

(a) cultivar dentro de un medio de cultivo para lentejas de agua un cultivo de plantas de lenteja de agua o un cultivo de nódulos de lenteja de agua, en donde dicho cultivo de plantas de lenteja de agua o dicho cultivo de nódulos de lenteja de agua se transforma establemente para expresar dicho polipéptido recombinante biológicamente activo, y en donde dicho polipéptido recombinante biológicamente activo se expresa a partir de una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia codificadora para dicho polipéptido recombinante y una secuencia codificadora conectada operativamente para un péptido de señal que dirige la secreción del polipéptido recombinante; y

(b) recoger dicho polipéptido recombinante del medio de cultivo para lentejas

de agua; en el que dicha secuencia de péptido de señal se selecciona de:

(a) el péptido de señal de interferón α-2b humano;

(b) el péptido de señal de quitinasa de Arabidopsis thaliana;

(c) el péptido de señal de α-amilasa de arroz; y

(d) el péptido de α-amilasa de arroz modificado indicado en el Nº ID SEC: 7.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido recombinante es interferón α-2b, hormona del crecimiento o un anticuerpo monoclonal.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha secuencia de nucleótidos tiene al menos un atributo seleccionado de:

(a) codones preferidos para lenteja de agua en la secuencia codificadora para dicho polipéptido recombinante;

(b) codones preferidos para lenteja de agua en la secuencia codificadora para dicho péptido de señal;

(c) un codón de inicio de la traducción que está flanqueado por una secuencia de nucleótidos de contexto de inicio de la traducción preferida para plantas;

(d) una secuencia de nucleótidos conectada operativamente que comprende un intrón vegetal que está insertado aguas arriba de la secuencia codificadora; y

(e) una secuencia líder 5' conectada operativamente.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que dichos codones preferidos para lenteja de agua son codones preferidos para Lemna gibba o codones preferidos para Lemna minor.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que al menos una secuencia codificadora seleccionada de la secuencia codificadora para dicho polipéptido recombinante y la secuencia codificadora para dicho péptido de señal comprende 70-100% de codones preferidos para Lemna gibba o codones preferidos para Lemna minor.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que dicho intrón vegetal tiene la secuencia indicada en el Nº ID SEC: 1.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que dicha secuencia de nucleótidos de contexto de inicio de la traducción preferida para plantas consiste en la secuencia de nucleótidos “ACC” o “ACA”, en el que dicho contexto está situado inmediatamente adyacente al extremo 5' del codón de inicio de la traducción.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que dicho interferón α2b tiene al menos 80% de identidad de secuencia con el Nº ID SEC: 4 o el Nº ID SEC: 5.

9. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que dicho interferón α2b es interferón α-2b humano.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que dicho interferón α-2b tiene la secuencia de aminoácidos indicada en el Nº ID SEC: 4 o el Nº ID SEC:

5.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el péptido de señal es el péptido de señal de α-amilasa de arroz que tiene la secuencia indicada en el Nº ID SEC: 3.

12. Un cultivo de plantas de lenteja de agua o un cultivo de nódulos de lenteja de agua, transformado establemente para expresar un polipéptido recombinante biológicamente activo a partir de una secuencia de nucleótidos que comprende una se

cuencia codificadora para dicho polipéptido recombinante y una secuencia codifica-dora conectada operativamente para un péptido de señal que dirige la secreción del polipéptido recombinante; en el que dicha secuencia del péptido de señal se selecciona de:

(a) el péptido de señal de interferón α-2b humano;

(b) el péptido de señal de quitinasa de Arabidopsis thaliana;

(c) el péptido de señal de α-amilasa de arroz; y

(d) el péptido de α-amilasa de arroz modificado indicado en el Nº ID SEC: 7.

13. El cultivo de plantas de lenteja de agua o el cultivo de nódulos de lenteja de agua transformado establemente de acuerdo con la reivindicación 12, en donde dicho cultivo de plantas de lenteja de agua o cultivo de nódulos de lenteja de agua se selecciona del grupo que consiste en el género Spirodela, el género Wolffia, el género Wolfiella y el género Lemna.

14. El cultivo de plantas de lenteja de agua o el cultivo de nódulos de lenteja de agua transformado establemente de acuerdo con la reivindicación 13, en donde dicho cultivo de plantas de lenteja de agua o cultivo de nódulos de lenteja de agua se selecciona de Lemna minor, Lemna miniscula, Lemna aequinoctialis y Lemna gibba.

15. Una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica interferón α-2b indicada en el Nº ID SEC: 2 conectada operativamente a la secuencia de nucleótidos que codifica el péptido de señal dada en el Nº ID SEC: 3.

16. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 15, que comprende adicionalmente la secuencia de nucleótidos que comprende el intrón dada en el Nº ID SEC: 1, en la que dicha secuencia de nucleótidos que comprende el intrón, dicha secuencia de nucleótidos que codifica el péptido de señal y dicha secuencia de nucleótidos que codifica interferón α-2b están conectadas operativamente.

Siguen 2 hojas de dibujos.