ENSAYOS PARA LA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS ANTI-ENZIMAS LISOSÓMICAS.

Ensayos para la detección de anticuerpos anti-enzimas lisosómicas. Campo de la invención La presente invención se refiere a procedimientos para identificar fluidos o tejidos corporales para anticuerpos, incluyendo anticuerpos neutralizantes y específicos del isotipo, frente a enzimas lisosómicas administradas como parte de una terapia de sustitución de enzimas. Antecedentes de la invención ES 2 366 059 T3 Las enfermedades de almacenamiento lisosómico, conocidas como mucopolisacaridosis (MPS) (Klock et al., Internat Pediatr. 9:40-48 (1994); Starr et al., Glycosylation & Disease 1: 165-176 (1994)), están provocadas por una deficiencia en una enzima o combinación de enzimas. Estas enfermedades de almacenamiento lisosómico se caracterizan por la acumulación intralisosómica de glucosaminoglucanos sin degradar, excreción urinaria excesiva de glucosaminoglucanos, deterioro mental y físico progresivo, y muerte prematura. Los pacientes nacen habitualmente sin los rasgos clínicos visibles de MPS, pero desarrollan afectación clínica progresiva. Cada tipo de MPS tiene una deficiencia de enzima lisosómica específica con un grado característico de afectación orgánica y velocidad de deterioro. Véase Muenzer, Adv. Pediatri. 33:269-302 (1986). Por ejemplo, MPS VI (síndrome de Maroteaux-Lamy) es una enfermedad de almacenamiento lisosómico en la que los pacientes afectados carecen de la enzima N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa (ASB). La enzima metaboliza el resto de sulfato del glucosaminoglucano (GAG) sulfato de dermatano (Neufeld et al., "The mucopolysaccharidoses" The Metabolic Basis of Inherited Disease, Eds. Scriver et al., New York: McGraw-Hill, 1989, p. 1565-1587). En ausencia de la enzima, la degradación por etapas del sulfato de dermatano está bloqueada, y el sustrato se acumula intracelularmente en el lisosoma en una amplia variedad de tejidos. La acumulación provoca un trastorno progresivo con afectación de múltiples órganos y tejidos, en la que el niño parece normal al nacer, pero habitualmente muere antes de la pubertad. El diagnóstico de MPS VI se realiza virtualmente a los 6-24 meses de edad, cuando el niño muestra una deceleración progresiva del crecimiento, un agrandamiento del hígado y del bazo, deformidades esqueléticas, rasgos faciales bastos, obstrucción de las vías respiratorias superiores, y deformidades de las articulaciones. En los niños con MPS VI se puede desarrollar un enturbiamiento progresivo de la córnea, hidrocefalia comunicante, o cardiopatía. La muerte resulta normalmente debida a infección respiratoria o cardiopatía. La MPS VI no está asociada típicamente con la alteración progresiva del estado mental, aunque las limitaciones físicas pueden impactar en el aprendizaje y desarrollo. Aunque la mayoría de los pacientes con MPS VI tienen la forma grave de la enfermedad, que habitualmente es mortal para la edad adolescente, se han descrito pacientes afectados con una forma menos grave de la enfermedad, que sobreviven durante décadas. Algunos pacientes mueren debido a complicaciones relacionadas con la enfermedad entre la niñez y la madurez temprana. Una forma para tratar enfermedades de almacenamiento lisosómico es mediante terapia intravenosa de sustitución de enzima (ERT) (Kakkis, Expert Opin Investig Drugs 11 (5):675-85 (2002)). La ERT aprovecha la vasculatura para llevar la enzima desde un único sitio de administración a la mayoría de los tejidos. Una vez que la enzima se ha distribuido ampliamente, debe ser captada en las células. La base para la captación en las células se encuentra en un rasgo único de las enzimas lisosómicas: las enzimas lisosómicas constituyen una clase separada de glucoproteínas definidas por fosfato en la posición 6 de restos de manosa terminales. La 6-fosfato de manosa se une con afinidad y especificidad elevadas mediante un receptor encontrado en la superficie de la mayoría de las células (Munier-Lehmann et al., Biochem. Soc. Trans. 24(1): 133-6 (1996); Marnell et al., J. Cell. Biol. 99(6):1907-16 (1984)). El receptor de 6-fosfato de manosa (MPR) dirige la captación de la enzima desde la sangre al tejido, y después media el enrutamiento intracelular al lisosoma. Se ha desarrollado ASB humana recombinante (rhASB) como una terapia de sustitución de enzimas para el tratamiento de MPS VI. rhASB se interna en el lisosoma a través del receptor de manosa-6-fosfato independiente de calcio (CIMPR). En este compartimiento subcelular, el bajo pH (pH 4-4,5) y la proteolisis disminuirían o eliminarían la interacción del anticuerpo con rhASB. Un efecto secundario potencial de la administración de la terapia de sustitución de enzimas (ERT) es el desarrollo de anticuerpos específicos de la enzima en pacientes que reciben múltiples rondas de terapia. Estos anticuerpos específicos de la enzima pueden precipitar sucesos adversos potenciales y cambios en la eficacia clínica, incluyendo reacciones de tipo anafilactoide asociadas con anticuerpos del isotipo IgE, cambios en el perfil farmacocinético, neutralización de la actividad enzimática en el lisosoma, interferencia con la captación de enzima mediada por el receptor, y ruptura de la tolerancia con respecto a las propias proteínas. Los ensayos fiables para medir de forma exacta el desarrollo de anticuerpos anti-enzima permitirían evaluar el régimen de tratamiento en un paciente que recibe ERT, y facilitar un diseño más eficiente de la terapia para el paciente (Mire-Sluis et al., J. Immunological Methods 289:1-16 (2004)). De este modo, existe todavía la necesidad en la técnica de ensayos sensibles, fiables, para detectar anticuerpos contra las enzimas lisosómicas útiles en terapia de sustitución de enzimas. 2 Linthorst et al., Kidney Int., 66(4):1589-1595, 2004 estudian la emergencia y propiedades de anticuerpos frente a una enzima lisosómica, -galactosidasa A humana recombinante (rh--Gal A), con la administración a pacientes con la enfermedad de Fabry. Se describe un ensayo a base de ELISA en el que se inmoviliza rh--Gal A sobre placas, y se detectan anticuerpos anti-rh--Gal A usando un anti-IgG humana de cabra marcado con peroxidasa. También se describen ensayos para detectar anticuerpos neutralizantes anti-rh--Gal A, para medir la actividad enzimática de rh-Gal A, detectar complejos de IgG-rh--Gal A, y medir la captación de rh--Gal A en glóbulos rojos. Sumario de la invención La invención se basa en el desarrollo de ensayos específicos y selectivos para medir anticuerpos asociados con compuestos terapéuticos proteicos, incluyendo terapia de sustitución de enzimas para trastornos de almacenamiento lisosómico. Un aspecto de la invención es un procedimiento para detectar anticuerpos específicos de enzimas lisosómicas (LE) en un animal (por ejemplo, un ser humano), que comprende las etapas siguientes: (a) poner en contacto una muestra de fluido corporal (por ejemplo, suero) procedente del animal con una primera enzima lisosómica marcada con un resto de captura, y una segunda enzima lisosómica marcada con un resto de detección, para formar un complejo de anticuerpo específico de LE/enzima lisosómica, (b) capturar el complejo de anticuerpo específico de LE/enzima lisosómica procedente de la etapa (a), poniendo en contacto el complejo de anticuerpo específico de LE/enzima lisosómica con un soporte sólido que se une específicamente al resto de captura, y (c) detectar la presencia de anticuerpos específicos de LE en la muestra de fluido corporal detectando la presencia de la segunda enzima lisosómica marcada con el resto de detección. Un segundo aspecto de la invención es un procedimiento para detectar anticuerpos que neutralizan a la enzima lisosómica (LE) en un animal (por ejemplo, un ser humano), que comprende las etapas siguientes: (a) aislar anticuerpos de iones fosfato y sulfato en una muestra de fluido corporal (por ejemplo, suero) del animal, (b) poner en contacto los anticuerpos aislados procedentes de la etapa (a) con una enzima lisosómica para formar un complejo de anticuerpo específico de LE/enzima lisosómica, (c) añadir un sustrato enzimático, y (d) detectar la cantidad de escisión del sustrato enzimático mediante la enzima lisosómica en presencia y ausencia de los anticuerpos aislados en la muestra de fluido corporal, en el que la escisión reducida en presencia, comparada con la ausencia, de los anticuerpos aislados indica la presencia de anticuerpos neutralizantes de LE en la muestra de fluido corporal. Un tercer aspecto de la invención es un procedimiento para detectar anticuerpos que inhiben la captación de enzima lisosómica (LE) en un animal (por ejemplo, un ser humano), que comprende las etapas siguientes: (a) incubar una muestra de fluido corporal (por ejemplo, suero) del animal con una enzima lisosómica marcada con un resto de detección, (b) poner en contacto la mezcla de incubación procedente de la etapa... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para detectar anticuerpos específicos de enzimas lisosómicas (LE) en un ser humano, que comprende las etapas siguientes: (a) poner en contacto una muestra de fluido corporal procedente del ser humano con una primera enzima lisosómica marcada con un resto de captura, y una segunda enzima lisosómica marcada con un resto de detección, para formar un complejo de anticuerpo específico de LE/enzima lisosómica, (b) capturar el complejo de anticuerpo específico de LE/enzima lisosómica procedente de la etapa (a) poniendo en contacto el complejo de anticuerpo específico de LE/enzima lisosómica con un soporte sólido que se une específicamente al resto de captura, y (c) detectar la presencia de anticuerpo específico de LE capturado procedente de la muestra de fluido corporal detectando la presencia de la segunda enzima lisosómica marcada con el resto de detección. 2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el resto de captura de la primera enzima lisosómica está unido al soporte sólido a través de una interacción no covalente. 3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el fluido corporal, la primera enzima lisosómica y la segunda enzima lisosómica se ponen en contacto juntos durante por lo menos aproximadamente 30 minutos antes de la etapa (b). 4. Procedimiento de la reivindicación 1, en el que la concentración molar de la primera enzima lisosómica es aproximadamente la misma o inferior a la concentración molar de la segunda enzima lisosómica. 5. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el límite de detección es (a) inferior a aproximadamente 500 ng/ml; o (b) inferior a aproximadamente 100 ng/ml. 6. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el límite de detección es de aproximadamente 1,7 ng/ml a aproximadamente 8,5 ng/ml. 7. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la primera y la segunda enzimas lisosómicas (a) son ambas arilsulfatasa humana recombinante (rhASB); o (b) son ambas -glucosidasa humana recombinante (rhGAA). 8. Procedimiento para detectar anticuerpos específicos de enzimas lisosómicas (LE) en un ser humano, que comprende las etapas siguientes: (a) capturar anticuerpo específico de LE en una muestra de fluido corporal procedente del ser humano poniendo en contacto la muestra de fluido corporal con una primera enzima lisosómica unida a un soporte sólido, (b) poner en contacto anticuerpo específico de LE capturado procedente de la etapa (a) con una segunda enzima lisosómica marcada con un resto de detección, y (c) detectar la presencia de anticuerpo específico de LE capturado procedente de la muestra de fluido corporal detectando la presencia de la segunda enzima lisosómica marcada con el resto de detección. 9. Procedimiento para detectar anticuerpos que neutralizan a la enzima lisosómica (LE) en un ser humano, que comprende las etapas siguientes: (a) aislar anticuerpos de iones fosfato y sulfato en una muestra de fluido corporal procedente del ser humano, (b) poner en contacto los anticuerpos aislados procedentes de la etapa (a) con una enzima lisosómica para formar un complejo de anticuerpo específico de LE/enzima lisosómica, (c) añadir un sustrato enzimático, y ES 2 366 059 T3 (d) detectar la cantidad de escisión del sustrato enzimático mediante la enzima lisosómica en presencia y ausencia de los anticuerpos aislados en la muestra de fluido corporal, en el que la escisión reducida en presencia, comparada con la ausencia, de los anticuerpos aislados indica la presencia de anticuerpos que neutralizan la LE en la muestra de fluido corporal. 26 ES 2 366 059 T3 10. Procedimiento según la reivindicación 9, en el que el límite de detección es inferior o igual a aproximadamente 7,5 µg/ml. 11. Procedimiento para detectar anticuerpos que inhiben la captación de enzima lisosómica (LE) en un ser humano, que comprende las etapas siguientes: (a) incubar una muestra de fluido corporal procedente del ser humano con una enzima lisosómica marcada con un resto de detección, (b) poner en contacto la mezcla de incubación procedente de la etapa (a) con un receptor de LE o un fragmento del mismo que se une a LE, estando unido dicho receptor de LE o un fragmento del mismo que se une a LE a un soporte sólido, y (c) detectar la unión de la enzima lisosómica marcada con el resto de detección procedente de la etapa (a) al receptor de LE o al fragmento del mismo que se une a LE, en el que una unión reducida en presencia de la muestra de fluido corporal indica que la muestra de fluido corporal contiene un anticuerpo que inhibe la captación de LE. 12. Procedimiento según la reivindicación 11, en el que el receptor de LE o un fragmento del mismo que se une a LE está unido al soporte sólido a través de una interacción no covalente. 13. Procedimiento según la reivindicación 11, en el que la etapa de incubación (a) se lleva a cabo durante por lo menos aproximadamente 30 minutos, y/o la etapa de puesta en contacto (b) se lleva a cabo durante por lo menos aproximadamente 1 hora. 14. Procedimiento según la reivindicación 11, en el que la LE es arilsulfatasa humana recombinante (rhASB), y el receptor de la LE es CIMPR o un fragmento del mismo que se une a rhASB. 15. Procedimiento según la reivindicación 11, en el que el límite de detección es inferior o igual a aproximadamente 45 µg/ml. 16. Procedimiento para detectar anticuerpos de isotipo IgE específicos de la enzima lisosómica (LE) en un ser humano, que comprende las etapas siguientes: (a) capturar IgE en una muestra de fluido corporal procedente del ser humano poniendo en contacto la muestra de fluido corporal con anticuerpo específico de IgE unido a un soporte sólido, (b) poner en contacto la IgE capturada procedente de la etapa (a) con una enzima lisosómica marcada con un resto de detección, y (c) detectar la cantidad de anticuerpo de isotipo IgE específico de LE en la muestra de fluido corporal detectando la cantidad de enzima lisosómica marcada con el resto de detección. 17. Procedimiento según la reivindicación 16, en el que el anticuerpo específico de IgE está unido al soporte sólido a través de una interacción no covalente. 18. Procedimiento según la reivindicación 16, en el que el anticuerpo específico de IgE no muestra reactividad cruzada detectable con IgG cuando IgG está presente en una concentración por lo menos aproximadamente 730 veces superior a IgE. 19. Procedimiento según la reivindicación 16, en el que el límite de detección es aproximadamente 1,23 ng/ml de IgE humana. 20. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1, 8, 9, 11 ó 16, en el que el fluido corporal es suero. 21. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 8, 9, 11 ó 16, en el que la LE es arilsulfatasa humana recombinante (rhASB). 27