Un método para detectar una enfermedad preneoplásica/neoplásica asociada con una ruta ras activada en un sujeto humano que comprende:

(a) detectar y cuantificar inmunológicamente el nivel promedio de proteína ras p21 total que comprende ras activado de mutación y normal en muestras de un fluido corporal tomado de individuos de una población de control; (b) detectar inmunológicamente y cuantificar cambios seriales en los niveles de proteína ras p21 totales que comprende ras activado de mutación y normal en muestras equivalentes del fluido corporal tomado del sujeto durante el tiempo; y (c) comparar los niveles de la proteína ras p21 totales en las muestras del sujeto con el nivel promedio de proteína ras p21 total en las muestras de control; en donde un nivel de proteína ras p21 total en las muestras del sujeto que está por encima del nivel promedio de proteína ras p21 total en las muestras de control es indicador de una ruta ras activada y la presencia de enfermedad preneoplásica/neoplásica en el sujeto, y en donde dicha detección inmunológica y cuantificación de las etapas (a) y (b) es mediante una inmunotransferencia en la forma de una inmunotransferencia intercalada utilizando una combinación de el Ras 17 de anticuerpo monoclonal que se secreta desde el hibridoma HB 10054 depositado en the American Type Culture Collection (ATCC), y el Ras 10 de anticuerpo monoclonal que se secreta desde el hibridoma HB 9426 depositado en el ATCC

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención está en el área general de genéticas médicas y en los campos de la oncología e inmunología. Más específicamente, la invención se dirige a la detección y cuantificación de ras p21 total en fluidos corporales, particularmente cambios seriales de los niveles ras p21 totales en los fluidos corporales de un sujeto. Adicionalmente, la invención se dirige a detectar y cuantificar ras p21 total en conjunto con una o más de otras proteínas, tal como, oncoproteínas, factores angiogénicos, marcadores de tumor, inhibidores, receptores del factor de crecimiento, proteínas de metástasis, y supresores de tumor.

ANTECEDENTE

La familia ras de oncogenes (homólogos al virus sarcoma de rata) pertenece a la familia de la proteína G de proteínas celulares vinculadas en la transducción de señal. Los genes ras codifican proteínas que se ubican en la superficie interna de la membrana de plasma y tienen actividad GTPasa. Normalmente, cuando se activa mediante el factor de crecimiento que se une a los receptores de membrana de plasma, las proteínas ras se unen al GTP, que resulta en activación de la señal ras. La familia del gen ras tiene tres miembros principales (H-ras, K-ras, y N-ras) que están entre los oncogenes más comúnmente activados encontrados en cáncer humano. Otros miembros de la familia del gen ras incluyen las subfamilias Rho/Rac, Rab, Arf y Ran.

Los tres genes ras principales (H-ras, K-ras, y N-ras) codifican las proteínas de lámina alfa/beta de 21 kD de 189 aminoácidos que se encuentran en todas las células eucarióticas en la superficie interna de la membrana de plasma. Las isoformas (denotadas H-Ras, N-Ras y K-Ras) codificadas por los tres genes ras se conocen colectivamente en la técnica como "p21" o "ras p21," y presentan un alto grado de homología (>90%) así como también efectores en la dirección 3' comunes y factores de intercambio de guanina-nucleótido en la dirección 5' (GEFS). Como es cierto para los otros miembros de la familia del gen ras, el ras p21 está en una proteína G de unión GDP/GTP intracelular en transducción de señal celular, que convierte señales del receptor tirosina quinasa en la membrana celular al núcleo para regular la proliferación y diferenciación celular normal [Pruitt y Der (2002)]. Las proteínas ras p21 activadas mediante sustituciones en las posiciones de aminoácido 12, 13, o 61 pueden actuar como oncoproteínas con una capacidad de transformación incrementada. Las formas mutadas de ras p21 se aseguran en un estado constitutivamente activo al reducir la hidrólisis de GTP, que resulta en señales no controladas para crecimiento celular. Cuando se mutan o sobreexpresan, las proteínas p21 son oncogénicas. Las proteínas ras p21 se sobreexpresan en 50-60% de los cánceres de mama y se mutan en aproximadamente 30% de todos los cánceres, notablemente cáncer pancreático y cáncer de colon.

La activación mutacional de ras oncogenes ha sido identificada en una variedad de cánceres así como también lesiones precursoras. Los genes ras mutacionalmente activados no son comunes en tumores de estómago, esófago, ovario, próstata y mama pero se reportan en 20-40% de los carcinomas de pulmón, 30% de leucemia mielogenosa aguda, 40-50% de tumores colorectales y tumores de tiroide y > 80% de tumores pancreáticos. En general, aproximadamente 30% de todos los neoplasmas humanos se han reportado que contienen una mutación de gen ras. [Adjei (2001); Bos (1989).] Las mutaciones H-ras son comunes en carcinomas de vejiga, riñón y tiroides; las mutaciones K-ras ocurren en carcinomas de células macrocíticas, colorectales y pancreáticos; y las mutaciones N-ras se encuentran en melanoma, carcinoma hepatocelular, y malignidades hematológicas. [Adjei (2001).] La transformación de las células mediante mutantes ras oncogénicos puede incrementar la expresión de metaloproteinasas, tal como gelatinasa y estromelisina, que puede mejorar la metástasis de tumor. Adicionalmente, la expresión del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) se incrementa en K-ras-y H-ras que transforma células epiteliales a través de la ruta Raf.

Existe alguna controversia en la técnica a cerca de la significancia del diagnóstico de ras p21 mutado versus sobreexpresado. Por ejemplo, Watson et al. [Cancer breast Res. Treat., 17(3): 161-169 (Jan-Feb 1991)] reporta que los niveles p21 elevados detectados por Western blot semicuantitativo son un indicador diagnóstico importante en pacientes con cáncer de mama temprano. En 2001, sin embargo, Karelia et al. [Int. J. Biol. Markers. 16(2): 97-104 (2001)] investiga la expresión de oncoproteína ras p21 en cáncer colorectal utilizando estudios inmunohistoquímicos, y concluye que la alteración genética de ras p21, no ras p21 positivo, es importante en determinar la agresividad biológica del cáncer colorectal.

Los anticuerpos que se utilizan frecuentemente para detectar ras en tumores son anticuerpos reactivos pan, que se unen a todas las tres formas de ras p21 (H-, N-y K-ras), mutadas y tipo natural. Por ejemplo, Sun et al., [Eur. J. Cancer, 27(12): 1646-1649 (1991)] utiliza el Ras 11 Mab reactivo pan en estudios inmunohistoquímicos para examinar la significancia de ras p21 en adenocarcinoma colorectal, y encuentra ras p21 positivo para correlacionarse con actividad proliferativa y por tener valor de pronóstico independiente.

Aunque están disponibles ensayos cuantitativos de ras p21 en tejidos humanos, los ensayos descritos anteriormente de ras p21 en fluidos corporales humanos son semi-cuantitativos. Como el ras se expresa normalmente, sería útil tener un indicador de una ruta de oncoproteína ras activada (regulada por aumento y/o mutacionalmente estimulada), tal como un ensayo cuantitativo de cambios seriales o elevados en circular niveles ras p21, en donde los niveles elevados o cambios en niveles ras p21 se puede utilizar para detectar la oncogenia dirigida a ras o cambios en el estado de un tumor dirigido a ras.

Carney, W.P., la Patente Estadounidense No. 5,443,956 (1995) describe inmunoensayos semicuantitativos de ras p21 total en plasma humano normal pero no en el suero correspondiente. La patente de Carney también describe el uso del Ras 17 Mab reactivo pan para detectar ras p21 total en ensayos ELISA de plasma humano normal. La EP 0 214 520 describe un inmunoensayo intercalado para RAS p21 que es de naturaleza cuantitativa.

En el 2000, por lo menos dos investigadores han reportado la presencia de las proteína ras en el suero de pacientes con cáncer de pulmón. En 1991, Brandt-Rauf, P.W., [J. Occup. Med., 33(9): 951-955 (Sept. 1991)] detecta ras en el suero de cinco de 11 pacientes con cáncer de pulmón y dos de 21 pacientes con enfermedades de pulmón no malignas utilizando inmunotransferencias, y sugiere el uso de ras como un marcador para la detección temprana del cáncer de tubo respiratorio. Anderson et al. También analiza niveles ras en el plasma de pacientes humanos con cáncer de pulmón utilizando Western blots. [Anderson et al., Mutat. Res. 349: 121-126 (1996); Anderson et al., Mutat. Res 403(1-2): 229-235 (1998); Anderson et al., Int. J. Hyg. Environ. Health. 204(1): 55-60 (Oct. 2001).] En el estudio de Anderson et al. 1996, se incrementan niveles ras en 45% de los pacientes vs. 6% de controles normales. En algunos de los estudios de Anderson et al., se utiliza el anticuerpo primario Ras 10, que detecta la proteína ras total (reactivo con ras normal y mutante). Los niveles ras no se cuantifican (en picogramas) en los estudios de Brandt-Rauf (1991) o Anderson et al..

Schneider et al. [Clin. Chem. Lab. Med., 38(4): 301-305 (2000)] reporta que el ras p21 no se puede detectar en suero de pacientes con cáncer de pulmón, o en suero de cualquiera de los grupos de estudio, y por lo tanto el ras no se puede considerar útil como un marcador para la detección temprana del cáncer de pulmón. Schneider et al. (2000) evalúa el suero de 65 pacientes macho con cáncer de pulmón, 29 con enfermedad de pulmón no maligno, y 44 controles, utilizando Ab-1 (Mabs de rata anti-ras p21 reactivos pan del clon Y13-259) que reacciona con H, K y N-ras, en tres diferentes métodos Western blot. Sin embargo, el no puede detectar ras en aquellas muestras de suero, aunque la proteíona ras de 1 ng se mide en los estándares.

Rundle et al. [Cancer Lett. 185(1): 71-78 (Nov. 8, 2002)] examina los niveles de ras p21 en plasma de pacientes con cáncer de mama, utilizando Western blots, análisis de imagen asistida por computador (unidades de píxel integradas), y un anticuerpo anti-ras reactivo...

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1. Un método para detectar una enfermedad preneoplásica/neoplásica asociada con una ruta ras activada en un sujeto humano que comprende:

(a) detectar y cuantificar inmunológicamente el nivel promedio de proteína ras p21 total que comprende ras activado de mutación y normal en muestras de un fluido corporal tomado de individuos de una población de control;

(b) detectar inmunológicamente y cuantificar cambios seriales en los niveles de proteína ras p21 totales que comprende ras activado de mutación y normal en muestras equivalentes del fluido corporal tomado del sujeto durante el tiempo; y

(c) comparar los niveles de la proteína ras p21 totales en las muestras del sujeto con el nivel promedio de proteína ras p21 total en las muestras de control; en donde un nivel de proteína ras p21 total en las muestras del sujeto que está por encima del nivel promedio de proteína ras p21 total en las muestras de control es indicador de una ruta ras activada y la presencia de enfermedad preneoplásica/neoplásica en el sujeto, y en donde dicha detección inmunológica y cuantificación de las etapas (a) y (b) es mediante una inmunotransferencia en la forma de una inmunotransferencia intercalada utilizando una combinación de el Ras 17 de anticuerpo monoclonal que se secreta desde el hibridoma HB 10054 depositado en the American Type Culture Collection (ATCC), y el Ras 10 de anticuerpo monoclonal que se secreta desde el hibridoma HB 9426 depositado en el ATCC.

2. El método de la reivindicación 1 que es diagnóstico adicional para dicha enfermedad preneoplásica/neoplásica, en donde dichos niveles de proteína ras p21 totales en las muestras del sujeto que se relacionan con el nivel promedio de ras p21 total en las muestras de control, son indicadores de un mejor diagnóstico o diagnóstico más pobre para dicho sujeto.

3. El método de la reivindicación 1 para uso en selección de terapia para un paciente humano con una enfermedad preneoplásica/neoplásica que comprende adicionalmente:

(d) decidir si se utiliza terapia de cáncer convencional y/o terapia de cáncer dirigida a ras para tratar el paciente con base en las diferencias entre los niveles de proteína ras p21 totales en las muestras del paciente y el nivel promedio de proteína ras p21 total en las muestras de control, y en vista de los cambios seriales entre los niveles de proteína ras p21 totales en las muestras del paciente.

4. El método de la reivindicación 3, en donde si un nivel de proteína ras p21 total en una muestra del paciente se encuentra que está por encima del nivel promedio de proteína ras p21 total en las muestras de control, y si los cambios seriales en los niveles de proteína ras p21 totales en las muestras del paciente reflejan que los niveles tienen tendencia a estar por encima del nivel promedio de proteína ras p21 total en las muestras de control, que concluyen que el paciente tiene una enfermedad preneoplásica/neoplásica controlada por oncogen ras , y decide utilizar una terapia dirigida a ras para tratar el paciente.

5. El método de la reivindicación 3 que es diagnóstico adicional para dicha enfermedad preneoplásica/neoplásica, en donde dichos niveles de la proteína ras p21 total en las muestras del sujeto que se relacionan con el nivel promedio de ras p21 total en las muestras de control son indicadores de un mejor diagnóstico o diagnóstico más pobre

37 para dicho sujeto, y en donde dicha decisión en la etapa (d) se basa en dicho diagnóstico.

6. El método de la reivindicación 3, en donde dicha terapia dirigida a ras se selecciona del grupo que consiste de inhibidores farnesiltransferasa (FTI), inhibidores tirosina quinasa, ureas bis-arilo, e inhibidores anticodificantes de ras.

7. El método de la reivindicación 6, en donde dicha terapia dirigida a ras es la sorafenib bis aril-urea (BAY 43-9006).

8. El método de la reivindicación 1, en donde dichos individuos de la población de control de la etapa (a) son del mismo género como el sujeto.

9. El método de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo monoclonal detector Ras 10 se biotinila.

10. El método de la reivindicación 3, en donde las muestras de fluido corporal son de un paciente con cáncer quien no ha respondido al tratamiento.

11. Un método para monitorear el estado de una enfermedad preneoplásica/neoplásica en un paciente, y/o monitorear a un paciente con una enfermedad preneoplásica/neoplásica responde a una terapia, que comprende detectar y cuantificar inmunológicamente cambios seriales en los niveles de proteína ras p21 totales que comprende ras activado de mutación y normal en muestras de un fluido corporal tomado de dicho paciente durante el tiempo; en donde los niveles incrementados de proteína ras p21 total durante el tiempo indican progresión de la enfermedad una respuesta negativa a dicha terapia, y en donde los niveles reducidos de la proteína ras p21 total indican remisión de enfermedad o una respuesta positiva a dicha terapia, en donde dicha detección inmunológica y cuantificación de las etapas es mediante una inmunotransferencia en la forma de una inmunotransferencia intercalada utilizando una combinación del Ras 17 de anticuerpo monoclonal que se secreta desde el hibridoma HB 10054 depositado en the American Type Culture Collection (ATCC), y el Ras 10 de anticuerpo monoclonal que se secreta desde el hibridoma HB 9426 depositado en el ATCC.

12. El método de la reivindicación 11, en donde dicha terapia es una terapia dirigida a ras.

13. El método de la reivindicación 11 que es diagnóstico adicional para dicha enfermedad preneoplásica/neoplásica, en donde dichos niveles de proteína ras p21 totales en las muestras del sujeto son indicadores de un mejor diagnóstico o diagnóstico más pobre para dicho sujeto.

14. El método de las reivindicaciones 2, 5 y 13, en donde dicho diagnóstico es un resultado clínico seleccionado del grupo que consiste de velocidad de respuesta (RR), beneficio de respuesta clínica completa (CR), beneficio de respuesta clínica parcial (PR), beneficio de enfermedad clínica estable (SO), progresión en el tiempo (TTP), y muerte con el tiempo (TTO).

15. El método de las reivindicaciones 2, 3 y 11, en donde dichas muestras tomadas de dicho sujeto o de dicho paciente son muestras de pretratamiento.

16. El método de las reivindicaciones 1, 3 y 11, que comprende adicionalmente el uso de una inmunotransferencia para detectar o detectar y los niveles cuantificados de una o más de otras proteínas en las muestras del paciente.

17. El método de la reivindicación 16, en donde dicha otra proteína es o dichas otras proteínas se seleccionan del grupo que consiste de inhibidores, oncoproteínas, receptores del factor de crecimiento, factores angiogénicos, proteínas de metástasis, marcadores de tumor, y supresores de tumor.

18. El método de la reivindicación 17, en donde dicho inhibidor es inhibidor de tejido de metaloproteinasa-1 (TIMP-1), dicha oncoproteína es HER-2/neu, dichos receptores del factor de crecimiento se seleccionan del grupo que consiste de receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y receptor del factor de crecimiento derivado de plaqueta (POGFR), dicho factor angiogénico es factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), dicha proteína de metástasis es activador de plasminógeno del tipo uroquinasa (uPA), dicho marcador de tumor es antígeno carcinoembriogénico (CEA), y dicho supresor de tumor es p53.

19. El método de la reivindicación 11, en donde las muestras de fluido corporal son de un paciente con cáncer quien no ha respondido al tratamiento.

20. El método de la reivindicación 19, en donde los niveles incrementados de ras p21 total y/o HER-2/neu son indicadores de una mayor probabilidad de recurrencia temprana o metástasis.

21. El método de las reivindicaciones 1, 3 y 11, en donde dicho fluido corporal se selecciona del grupo que consiste de sangre, suero, plasma, orina, saliva, semen, exudado de mama, fluido cerebroespinal, lágrimas, esputo, mocos, plama, citosoles, ascitis, efusiones pleurales, fluido amniótico, lavados de vejiga y lavados bronquioalveolares.

22. El método de las reivindicaciones 1, 3 y 11, en donde dicho fluido corporal es suero o plasma.

23. El método de las reivindicaciones 1, 3 y 11, en donde dicha enfermedad preneoplásica/neoplásica asociada con una ruta ras activada se selecciona del grupo que consiste de cáncer colorectal, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de células macrocíticas, cáncer de pulmón de célula pequeña, leucemia mielogenosa aguda, cáncer tiroide, cáncer pancreático, cáncer de vejiga, cáncer de hígado, melanoma, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer cervical, cáncer de cabeza y cuello, carcinoma hepatocelular y malignidad hematológica.