Un ensayo para la identificación de inhibidores de la replicación del virus del papiloma humano (VPH),

que comprende: a) poner en contacto un dominio de transactivación E2 de VPH con una sonda para formar un complejo E2:sonda y medir una señal de dicha sonda para establecer un nivel basal; b) incubar el complejo E2:sonda con un compuesto prueba y medir la señal de dicha sonda;c) comparar la señal del paso b) con la señal del paso a); en el que dicha sonda es un compuesto de fórmula (1) o sus enantiómeros o diastereoisómeros del mismo: **(Ver fórmula)**en el que: A es un anillo homocíclico de 5 o 6 miembros, o un anillo heterocíclico de 5 o 6 miembros que contiene 1 o more heteroátomos seleccionados de N, O y S; X es H y W es OH; o X y W juntos forman un grupo carbonilo o un epóxido; 20 R1 es H; o uno o dos sustituyentes independientemente seleccionados de entre el grupo que consiste en: hidroxi, halo, alquilo inferior, alcoxi inferior, tioalquilo inferior, haloalquilo, o -C(O) R2 en el que R2 es alquilo inferior, ariloxi o benciloxi; Y es fenilo opcionalmente mono o disustituido con R5 o C(O)R6, en el que R5 es alquilo inferior, cicloalquilo inferior, alcoxi inferior, halo, hidroxi, nitrilo o trifluorometilo, y R6 es alquilo inferior, cicloalquilo inferior, alcoxi inferior, hidroxi o trifluorometilo; estando dicho anillo fenilo opcionalmente fusionado con un anillo saturado o insaturado de 4 a 6 miembros que contiene opcionalmente un heteroátomo seleccionado de N, O y S; o Y es un heterociclo (Het) que contiene uno o más heteroátomos seleccionados de N, O o S, dicho Het opcional-mente mono o disustituido con R5 o C(O)R6, en el que R5 y R6 son como se ha definido anteriormente; estando dicho Het opcionalmente fusionado con un anillo saturado o insaturado de 4 a 6 miembros que contiene opcionalmente un heteroátomo seleccionado de N, O y S; o Y es etileno-fenilo, dicha porción de etileno está opcionalmente monosustituida con alquilo inferior, en el que dicho anillo fenilo está opcionalmente mono o disustituido con R5 o C(O)R6, en el que R5 y R6 son como se ha definido anteriormente; estando dicho anillo fenilo opcionalmente fusionado con un anillo saturado o insaturado de 4 a 6 miembros que contiene opcionalmente un heteroátomo seleccionado de N, O y S; o Y es etileno-Het, dicha porción de etileno está opcionalmente monosustituida con alquilo inferior, en el que el Het está opcionalmente mono o disustituido con R5 o C(O) R6, en el que R5 y R6 son como se ha definido anteriormente; dicho Het está opcionalmente fusionado con un anillo saturado o insaturado de 4 a 6 miembros que contiene opcionalmente un heteroátomo seleccionado de N, O y S; R3 está seleccionado del grupo que consiste en: alquilo inferior, cicloalquilo inferior, alquileno inferior, arilo o aralquilo inferior, todos ellos opcionalmente mono o disustituidos por: alquilo inferior, cicloalquilo inferior, haloalquilo, halo, CN, azido, alcoxi inferior, alquilacilo inferior, tioalquilo C1-6, alquilsulfonilo C1-6, NHC(O)-alquilo inferior, NHC(O)-arilo, NHC(O)-O-alquilo inferior, NHC(O)Oarilo, arilo, ariloxi, hidroxi, nitro, amino, o Het, dicho Het opcionalmente mono o disustituido con alquilo inferior, cicloalquilo inferior, alcoxi inferior, halo, hidroxi, nitrilo, trifluorometilo, C(O)R6 en el que R6 es como se ha definido anteriormente; dicho cicloalquilo inferior, arilo, aralquilo inferior o Het está opcionalmente fusionado con un anillo saturado o insaturado de 4 a 6 miembros que contiene opcionalmente un heteroátomo seleccionado de N, O y S; y R4 es un ácido carboxílico, una sal o un éster del mismo; o un derivado del mismo, en el que dicho derivado es una sonda de fórmula (I) marcada con un marcaje detectable o una cola de afinidad, en el que las líneas onduladas representan enlaces de estereoquímica inespecífica; y en el que dicha señal se selecciona de entre: fluorescencia, transferencia de energía por resonancia, fluorescencia de resolución temporal, radioactividad, polarización de fluorescencia, cambio en las propiedades espectrales intrínsecas, luminescencia y resonancia en plasma; en la que una modulación en dicha señal es indicativo que dicho compuesto prueba se une a dicho dominio de transactivación

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención en general, está relacionada con un ensayo para identificar inhibidores de la replicación del virus del papiloma (VP), en particular del virus del papiloma humano (VPH). En particular, la presente invención proporciona una sonda nueva en un ensayo competitivo para identificar inhibidores de la replicación del VPH. Más en particular, la presente invención está relacionada con la síntesis y uso de una sonda que se une con especificidad al dominio de transactivación (TDA) de E2 del VPH para formar un complejo con este, y que es capaz de ser desplazado mediante inhibidores del VPH.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los virus del papiloma son virus de DNA sin cubierta que inducen lesiones hiperproliferativas del epitelio. Los virus del papiloma están extendidos ampliamente en la naturaleza y se han identificado en los vertebrados superiores. Los virus se han caracterizado, entre otros, de humanos, ganado, conejos, caballos, y perros. El primer virus del papiloma se describió en 1933 como un virus del papiloma de la cola de algodón de conejo (CRPV). Desde entonces, el virus del papiloma de la cola de algodón de conejo así como el virus del papiloma bovino de tipo 1 (PVB-1) han servido como prototipos experimentales para estudios en virus del papiloma. La mayoría de virus del papiloma de animales están asociados con lesiones proliferativas exclusivamente epiteliales, y la mayoría de lesiones en animales son cutáneas. En humanos existen más de 75 tipos de virus del papiloma identificados y se han catalogado según el lugar de infección: epitelio cutáneo y epitelio mucoso (mucosa oral y genital). Las enfermedades relacionadas con la piel incluye verrugas planas, verrugas plantares, etc. Las enfermedades relacionadas con la mucosa incluye papilomas laríngeos y enfermedades anogenitales como los carcinomas cervicales.

Existen más de 25 tipos de VPH que están implicados en enfermedades anogenital, y se agrupan dentro de los tipos de "riesgo bajo" y "riesgo alto". Los tipos de riesgo bajo incluye el VPH de tipo 6 y de tipo 11 e induce mayoritariamente lesiones benignas como condiloma acuminata (verrugas genitales) y lesiones intraepiteliales escamosas de bajo grado (SIL). En los Estados Unidos, el 1 % de la población sexual-mente activa presenta verrugas genitales de las que el 90% se atribuyen al VPH-6 y VPH-11.

Los tipos de riesgo alto están asociados con SIL de grado alto y cáncer cervical e incluye más frecuentemente VPH de tipo 16, 18, 31, 33, 35, 45, 52, y 58. La progresión de SIL de grado bajo a SIL de grado alto es más frecuente para las lesiones que contienen VPH-16 y 18 de alto riesgo en comparación con las que contienen tipos de VPH de bajo riesgo. Además, sólo cuatro tipos de VPH se han detectado frecuentemente en el cáncer cervical (tipos 16, 18, 31 y 45). Se diagnostican alrededor de 500,000 nuevos casos al año de cáncer invasivo de cérvix en el mundo entero.

El ciclo de vida del VP está acoplado muy próximo a la diferenciación de los queratinocitos. Se cree que la infección ocurre en un lugar de disrupción del tejido en el epitelio basal. A diferencia de las células normales, la maquinaria de replicación del DNA celular se mantiene si la célula se mantiene en diferenciación vertical. A medida que las células infectadas experimentan una diferenciación progresiva, el número de copias del genoma viral y la expresión génica viral aumentan a su vez, con la expresión final de genes tardíos y ensamblaje de viriones en los queratinocitos finalmente diferenciados y la liberación de partículas vira-les.

Las cadenas codificantes para cada uno de los virus del papiloma contienen aproximadamente diez marcos de lectura abiertos (ORF) traduccionales designados, que se han clasificado como ORF tempranos o ORF tardíos en función de su localización en el genoma. E1 a E8 se expresan temprano en el ciclo de replicación viral, y dos genes tardíos (L1 y L2) codifican las proteínas mayores y menores de la cápside respectivamente. Los productos génicos E1 y E2 funcionan en la replicación del DNA viral, mientras que E5, E6 y E7 se expresan junto con la proliferación de la célula huésped. Los productos génicos L1 y L2 están involucrados en la estructura del virión. La función de los productos génicos E3 y E8 es desconocida en la actualidad.

Estudies del VPH han demostrado que las proteínas E1 y E2 son las dos únicas proteínas virales que son necesarias àra la replicación del DNA viral in vitro e in vivo, además

de la maquinaria de replicación de DNA del huésped. Este re

quisito es similar a la del virus del papiloma bovino de tipo 1 (VPB-1). De hecho, existe un alto grado de similitud entre las proteínas E1 y E2 y las secuencias ori de todos los virus del papiloma (VP) independientemente de la especie viral y del tipo. Las evidencias extraídas de los estudies de VPB-1 mostraron que E1 posee actividades ATPasa y helicasa que son necesarias en la replicación de DNA viral.

La proteína E2 es un activador transcripcional que se une a la proteína E1 y forma un complejo que se une específicamente a la secuencia ori (Mohr et al., 1990, Science 250:1694-1699). Se cree que E2 aumenta la unión de E1 al origen de replicación del VPB (Seo et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci., 90:2865-2869). En el VPH, Lui et al. sugirieron que E2 estabiliza la unión de E1 al ori (1995, J. Biol. Chem., 270(45):27283-27291). El dominio de transactivación de VPH-16 (TAD) de E2 se ha descrito en J.E. Burns et al., 1998 (Acta Cryst. D54,1471-1474) y se encontró que eran necesarios los aminoácidos 1-190 y suficientes para la unión de E1 (Yasugi et al., 1997, J. Virol. 71, 891-899).

Por lo tanto, para impedir esta enfermedad, es deseable un compuesto químico que interfiera con o inhiba la replicación de DNA viral. Los métodos descritos anteriormente para evaluar los inhibidores de la interacción E1-E2 (patente Estadounidense 5.925.516 y Titolo et al. 1999, J. Virol. 73, 5282-5293) han confiado en la producción de las proteínas E1 y E2 de longitud completa. El E2 y especialmente E1 del VPH han sido difíciles de obtener en cantidad suficiente y pureza para un cribaje de fármacos efectivo (White et al., 2001,

J. Biol. Chem., 276(25), 22426-22438; Rocque et al., 2000,

Protein, Expression Purif. 18, 148-159). Además, un ensayo común para esta interacción involucra la medición de la unión cooperativa de E1 y E2 al DNA de doble cadena referido en este documento como ensayo de unión a DNA de E1 dependiente de E2 (Titolo et al. 1999, J. Virol. 73, 5282-5293). Este método es muy sensible a la concentración de sal y al pH, como ya se sabe que es cierto en general para las interacciones de proteína-DNA. Además, las interacciones de proteína-DNA son sensibles a la inhibición mediante intercala-dores no específicos de DNA (Lai et al., 1992, Proc Natl. Acad. Sci. USA , 89(15):6958-62).

Una familia de compuestos químicas que inhiben la replicación del VPH se describe en WO 02/50082 publicada el 27 de Junio de 2002, que es un estado de la técnica bajo el Artículo 54(3) EPC. El mecanismo de acción de estos inhibido-res fue identificado y se encuentran que inhiben la interacción E1-E2 mediante la unión al TAD de E2. Por ello hemos racionalizado que, utilizados como sondas, estos pueden desplazarse por compuestos prueba que también inhiben o interrumpen la interacción E1:E2, una interacción que es crítica para el complejo para unirse al DNA y continuar con la replicación viral. La validación de esta razón fundamental pudo obtenerse analizando los inhibidores identificados en el presente ensayo con un ensayo de unión a DNA de E1 dependiente de E2 bien conocido.

La presente invención proporciona así una sonda y un nuevo ensayo de desplazamiento para el cribaje de inhibido-res potenciales de replicación viral de papiloma. De forma

ventajosa, este ensayo de desplazamiento de la presente in

vención es fácil de utilizar y sin gasto y fácil de ajustar la concentración de sal o niveles de pH. Este tipo de ensayo es también susceptible a una alta sensibilidad y un formato de alto rendimiento, y utiliza una proteína que posee un pe

5 so molecular bajo, que es fácil de purificar.

Es otra ventaja de la presente invención proporcionar una sonda que se une al dominio de transactivación del E2 de VPH con gran afinidad, y que se ve desplazado por inhibido-res del VPH.

10 RESUMEN DE LA INVENCIÓN En una primera realización,...

1. Un ensayo para la identificación de inhibidores de la replicación del virus del papiloma humano (VPH), que comprende:

5 a) poner en contacto un dominio de transactivación E2 de VPH con una sonda para formar un complejo E2:sonda y medir una señal de dicha sonda para establecer un nivel basal;

b) incubar el complejo E2:sonda con un compuesto prueba y medir la señal de dicha sonda; 10 c) comparar la señal del paso b) con la señal del paso a); en el que dicha sonda es un compuesto de fórmula (1) o sus enantiómeros o diastereoisómeros del mismo:

**(Ver fórmula)**

en el que:

15 A es un anillo homocíclico de 5 o 6 miembros, o un anillo heterocíclico de 5 o 6 miembros que contiene 1 o more heteroátomos seleccionados de N, O y S; X es H y W es OH; o X y W juntos forman un grupo carbonilo o un epóxido;

20 R1 es H; o uno o dos sustituyentes independientemente seleccionados de entre el grupo que consiste en: hidroxi, halo, alquilo inferior, alcoxi inferior, tioalquilo inferior, haloalquilo, o -C(O) R2 en el que R2 es alquilo inferior, ariloxi o benciloxi;

Y es fenilo opcionalmente mono o disustituido con R5 o C(O)R6, en el que R5 es alquilo inferior, cicloalquilo inferior, alcoxi inferior, halo, hidroxi, nitrilo o trifluorometilo, y R6 es alquilo inferior, cicloalquilo inferior, alcoxi inferior, hidroxi o trifluorometilo; estando dicho anillo fenilo opcionalmente fusionado con un anillo saturado o insaturado de 4 a 6 miembros que contiene opcionalmente un heteroátomo seleccionado de N, O y S;

o Y es un heterociclo (Het) que contiene uno o más heteroátomos seleccionados de N, O o S, dicho Het opcional-mente mono o disustituido con R5 o C(O)R6, en el que R5 y R6 son como se ha definido anteriormente; estando dicho Het opcionalmente fusionado con un anillo saturado o insaturado de 4 a 6 miembros que contiene opcionalmente un heteroátomo seleccionado de N, O y S;

o Y es etileno-fenilo, dicha porción de etileno está opcionalmente monosustituida con alquilo inferior, en el que dicho anillo fenilo está opcionalmente mono o disustituido con R5 o C(O)R6, en el que R5 y R6 son como se ha definido anteriormente; estando dicho anillo fenilo opcionalmente fusionado con un anillo saturado o insaturado de 4 a 6 miembros que contiene opcionalmente un heteroátomo seleccionado de N, O y S;

o Y es etileno-Het, dicha porción de etileno está opcionalmente monosustituida con alquilo inferior, en el que el Het está opcionalmente mono o disustituido con R5 o C(O) R6, en el que R5 y R6 son como se ha definido anteriormente; dicho Het está opcionalmente fusionado con un anillo satura

do o insaturado de 4 a 6 miembros que contiene opcionalmente

un heteroátomo seleccionado de N, O y S;

R3 está seleccionado del grupo que consiste en: alquilo inferior, cicloalquilo inferior, alquileno inferior, arilo o aralquilo inferior, todos ellos opcionalmente mono o disustituidos por:

alquilo inferior, cicloalquilo inferior, haloalquilo, halo, CN, azido, alcoxi inferior, alquilacilo inferior, tioalquilo C1-6, alquilsulfonilo C1-6, NHC(O)-alquilo inferior, NHC(O)-arilo, NHC(O)-O-alquilo inferior, NHC(O)Oarilo, arilo, ariloxi, hidroxi, nitro, amino, o Het, dicho Het opcionalmente mono o disustituido con alquilo inferior, cicloalquilo inferior, alcoxi inferior, halo, hidroxi, nitrilo, trifluorometilo, C(O)R6 en el que R6 es como se ha definido anteriormente;

dicho cicloalquilo inferior, arilo, aralquilo inferior

o Het está opcionalmente fusionado con un anillo saturado o insaturado de 4 a 6 miembros que contiene opcionalmente un heteroátomo seleccionado de N, O y S; y

R4 es un ácido carboxílico, una sal o un éster del mismo;

o un derivado del mismo, en el que dicho derivado es una sonda de fórmula (I) marcada con un marcaje detectable o una cola de afinidad, en el que las líneas onduladas representan enlaces de estereoquímica inespecífica; y en el que dicha señal se selecciona de entre: fluorescencia, transferencia de energía por resonancia, fluorescencia de resolución temporal, radioactividad, polarización de fluorescencia, cambio en las propiedades espectrales intrínsecas, luminescencia y resonancia en plasma; en la que una modulación

en dicha señal es indicativo que dicho compuesto prueba se une a dicho dominio de transactivación.

2. Un ensayo para la identificación de inhibidores de la replicación del virus del papiloma humano (VPH), que comprende:

a) poner en contacto un dominio de transactivación de la proteína E2 de VPH con una sonda de fórmula I como se ha definido en la reivindicación 1 para formar un complejo E2:sonda y medir una señal de dicha sonda para establecer un nivel basal;

b) incubar la proteína E2 con un compuesto prueba;

b') añadir una sonda de fórmula (I) a dicha mezcla de E2 y compuesto prueba del paso b) y medir la señal de dicha sonda; y

c) comparar la señal del paso a) con la señal del paso b');

en la que una modulación en dicha señal e una indicación que dicho compuesto prueba se une a dicho dominio de transactivación.

3. El ensayo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que dicha señal detectable se selecciona de entre:

una señal fluorescente, una señal quimioluminiscente, una señal colorimétrica, un marcador enzimático y un isótopo radiactivo.

4. El ensayo de acuerdo con la reivindicación 3, en el que dicha señal fluorescente se selecciona de entre: fluoresceína, Oregon green, dansilo, rodamina, tetrametilrodamina, Texas red, ficoeritrina BODIPY® FL, BODIPY® 493/503 y

Eu3+ .

5. El ensayo de acuerdo con la reivindicación 3, en el

que dicha señal quimioluminiscente es la luciferasa.

6. El ensayo de acuerdo con la reivindicación 3, en el

que dicho isótopo radiactivo se selecciona de entre: 3H, 14C 5 y 125I.

7. El ensayo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que dicha cola de afinidad comprende un ligando cuya fuerte afinidad por un receptor se utiliza para extraer a partir de una solución la entidad a la que dicho ligando está unido.

8. El ensayo de acuerdo con la reivindicación 7, en el que dicho ligando se selecciona de entre: biotina, un péptido poli-histidina y un epítopo definido reconocible mediante un anticuerpo específico. 9. El ensayo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que dicha sonda es un compuesto de fórmula (I), presente en una estereoquímica relativa "cis/cis" representada como sigue:

**(Ver fórmula)**

en el que R1 es un grupo alquilo inferior; A es un anillo carbocíclico de 6 miembros o un heterociclo que contiene azufre de 5 miembros; X es H y W es OH; o X y W forman un grupo carbonilo; Y es un grupo fenilo opcionalmente mono o disustituido con alquilo inferior o halo; R3 es arilo sustituido con una señal fluorescente, una señal quimioluminiscente o una señal radiactiva; y R4 es un grupo carboxilo.

10. El ensayo de acuerdo con la reivindicación 9, en el que dicha sonda comprende enantiómeros puros de los compuestos de fórmula (Ia) o (Ib) con la estereoquímica relativa "cis/cis":

**(Ver fórmula)**

5 o en el que R1, A, X, W, Y, R3 y R4 son como se han definido en la reivindicación 9.

11. El ensayo de acuerdo con la reivindicación 10, en

el que dicha sonda comprende enantiómeros puros cis/cis de 10 los compuestos de fórmulas IIa y IIb:

**(Ver fórmula)**

en el que R1 es un grupo alquilo inferior; X y W forman un grupo carbonilo; Y es un grupo fenilo opcionalmente mono-

o disustituido con alquilo inferior o halo; R3 es arilo sus

tituido con una señal fluorescente, una señal quimioluminis15 cente o una señal radioactiva; y R4 es un grupo carboxilo.

12. El ensayo de acuerdo con la reivindicación 11, en el que en dicha sonda, R1 es metilo, Y es fenilo sustituido con R5 en el que R5 es uno o dos sustituyentes seleccionados de entre: Cl o Br; y R3 es fenilo sustituido con -CH2-NHC(O)-R3A o -(CH2)-NHC(S)-R3A en el que R3A es una señal fluorescente, una señal quimioluminiscente o una señal radioactiva.

13. El ensayo de acuerdo con la reivindicación 12, en el que dicha sonda posee la siguiente fórmula:

**(Ver fórmula)**

en la que R5 es di-bromo, y R3 es fenilo sustituido con -CH2-NH-C(O)-R3A o -(CH2)-NH-C(S)-R3A en el que R3A es un -CH3 tritiado, una señal fluorescente o una señal quimioluminiscente.

14. El ensayo de acuerdo con la reivindicación 13, en el que R3 se selecciona de entre:

y

en el que el * representa una señal de tritio.

15. El ensayo de acuerdo con la reivindicación 14, en el que dicho R3 es

en el que el * representa una señal de tritio.

16. El ensayo de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en el que dicha sonda se selecciona de entre:

17. El ensayo de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en el que dicho dominio de transactivación E2 se selecciona de entre: la proteína E2 completa, una proteína que comprende los aminoácidos 1-190 de la proteína E2 completa,

**(Ver fórmula)**

**(Ver fórmula)**

**(Ver fórmula)**

5 Id. de Sec. Nº 1, Id. de Sec. Nº 2 y Id. de Sec. Nº 5.

18. El ensayo de acuerdo con la reivindicación 17, en el que dicho dominio de transactivación E2 procede de un virus del papiloma de un tipo de bajo riesgo.

19. El ensayo de acuerdo con la reivindicación 18, en el que dicho virus del papiloma de bajo riesgo se selecciona de entre: VPH-6 y VPH-11.

20. El ensayo de acuerdo con la reivindicación 19, en el que dicho virus del papiloma de bajo riesgo es el VPH-11.

21. Una sonda que se une al dominio de transactivación E2 del VPH-11 y que puede ser desplazada por un inhibidor potencial del mismo; y dicha sonda posee la fórmula:

**(Ver fórmula)**

en la que R5 es alquilo inferior, cicloalquilo inferior, alcoxi inferior, halo, hidroxi, nitrilo o trifluorometilo, y R3 es arilo sustituido con una señal fluorescente, una señal quimioluminiscente o una señal radiactiva. 22. La sonda de acuerdo con la reivindicación 21, en la que R5 es uno o dos sustituyentes halógeno.

23. La sonda de acuerdo con la reivindicación 22, en la que R3 es fenilo sustituido con -CH2-NH-C(O)-R3A o -(CH2)-NH-C(S)-R3A en el que R3A es una señal fluorescente,

10 una señal quimioluminiscente o una señal radiactiva.

24. La sonda de acuerdo con la reivindicación 23, en la que R3 se selecciona de entre:

y

en el que el * representa una señal de tritio.

25. La sonda de acuerdo con la reivindicación 24, en la que dicho R3 es

**(Ver fórmula)**

en el que el * representa una señal de tritio.

26. La sonda de acuerdo con la reivindicación 21, seleccionada de entre el grupo que consiste en:

27. La utilización de una sonda como se define en la reivindicación 21 en el desarrollo de un ensayo para identificar inhibidores del VPH.

y