DISPOSITIVO Y MÉTODO PARA CULTIVO TRIDIMENSIONAL DE CÉLULAS ADHERENTES.

La presente invención se refiere a un dispositivo y método para cultivo tridimensional de células adherentes basado en el uso de soportes filamentosos inmersos en un medio de cultivo

Dispositivo y método para cultivo tridimensional de células adherentes. Campo técnico de la invención La presente invención se refiere a un dispositivo y método para cultivo tridimensional de células adherentes basado en el uso de soportes filamentosos inmersos en un medio de cultivo. Estado de la técnica El cultivo celular es ampliamente empleado en la industria biotecnológica como un método para obtener diferentes productos biológicos producidos por las células y también como un método para producir células para diferentes aplicaciones, como puede ser la terapia celular. El cultivo celular también es empleado en investigación como un método muy conveniente para estudiar interacciones celulares o el efecto de diferentes sustancias en el metabolismo celular. En los métodos de cultivo celular, las células pueden ser cultivadas en suspensión o adheridas a una superficie, como es el caso de las células dependientes de anclaje. Las células dependientes de anclaje se cultivan tradicionalmente como una única capa de células en la superficie interna de recipientes con diferentes formas. Estas superficies se sumergen en un medio de cultivo apropiado, como puede ser el caso de las botellas rodantes o los frascos de cultivo tipo T, donde el medio de cultivo se introduce en el interior del recipiente, de manera que baña las paredes donde se realiza el cultivo celular. Este tipo de cultivos son empleados, entre otras cosas, para realizar estudios de eficacia de diversas sustancias sobre el desarrollo de determinados fenómenos celulares como pueden ser la angiogénesis o la metástasis. Sin embargo, el hecho de que el crecimiento en monocapa no reproduzca las condiciones en las que las células se encuentran en la naturaleza, limita la aplicación e interpretación de los resultados obtenidos en dichos estudios. Otras alternativas emplean soportes particulados con estructura macroporosa para el cultivo celular. Las células crecen en la superficie externa de las partículas y dentro de las cavidades internas, o poros, de las partículas del soporte, las cuales se mantienen en suspensión mediante diferentes modos de agitación. También es conocido la preparación de los llamados esferoides, preparados de manera artesanal y en los que muchas células crecen juntas en suspensión, adheridas unas a otras, hasta el límite impuesto por la fuerza gravitacional que actúa sobre el esferoide en crecimiento que se mantiene en suspensión. Los esferoides son de particular interés en el estudio de cultivos celulares tridimensionales, ya que los esferoides simulan con mayor precisión que los cultivos superficiales las condiciones naturales en las que las células se encuentran en los organismos vivos, donde más que estructurarse en forma de monocapas, las células forman estructuras tridimensionales y tejidos. En la solicitud de patente PCT/EP2006/064483, se describe el cultivo de células en la superficie de microhilos en forma de monocapas. En la descripción de la invención, se describen distintas distribuciones de microhilos adecuadas para llevar a cabo el objetivo de cultivar las células en monocapas en la superficie de los hilos. De especial interés es el desarrollo de cultivos tridimensionales de células adherentes en el caso de la producción de células terapéuticas, tanto somáticas como troncales, ya que un factor clave para el éxito de las terapias desarrolladas a partir de la implantación de células, es disponer de métodos de producción con suficiente productividad y que no afecten al grado de diferenciación de las células cultivadas. En estas aplicaciones, es necesario disponer de métodos de producción de células donde se consiga una elevada productividad, superior a cientos de miles de células por lote, y con elevada homogeneidad. Los métodos o dispositivos existentes aplicados al cultivo tridimensional de células adherentes adolecen de los siguientes problemas: - En el caso de los recipientes sobre cuya superficie interior crecen las células, estas se ven forzadas a crecer en dos dimensiones hasta que toda la superficie disponible para cultivo ha sido saturada por células, momento en el cual podrían iniciar el crecimiento tridimensional. Sin embargo, las células que están en contacto con la superficie, una vez que son cubiertas por sucesivas capas celulares, ven limitado su acceso a los nutrientes provistos por el medio de cultivo, por lo que crecen en un entorno drásticamente diferente al de las células de las capas superiores del cultivo. - En el caso de los soportes particulados macroporosos que se mantienen en suspensión mediante agitación, las células que crecen en la superficie de las partículas están sometidas a un choque continuo contra el resto de partículas en suspensión, por lo que son dañadas por las fuerzas de fricción. Mientras que las células que crecen en el interior de los poros, se encuentran sometidas a diferentes micro-ambientes creados en el interior de dichos poros, lo cual implica unas condiciones heterogéneas de cultivo. Además, una vez concluido el cultivo, la recuperación de las células está dificultada por el impedimento estérico, ya que incluso si las células son despegadas de la superficie interna de los poros, la mayoría de ellas queda atrapada en el interior de las partículas y no puede ser recuperada. 2 ES 2 351 573 A1 - En el caso de los esferoides, aunque tanto el entorno de cultivo como su similitud con un cultivo tridimensional perfecto son adecuadas, el método de preparación es extremadamente improductivo, y los tamaños de los cultivos obtenidos están limitados a pocos cientos o miles de células. Este tamaño máximo tan reducido de los cultivos tridimensionales que se pueden alcanzar con los esferoides es debido a los límites impuestos por la fuerza gravitacional que hace caer a los esferoides que crecen en suspensión. Para solucionar estos problemas, es necesario encontrar el modo de mantener indefinidamente en suspensión y en un ambiente homogéneo, un cultivo tridimensional, sin someterlo a fuerzas de fricción provocadas por choques entre las partículas o turbulencias provocadas por la agitación del medio de cultivo. Descripción de la invención La presente invención describe un dispositivo y un método para cultivo tridimensional de células adherentes mediante la aplicación de un medio de cultivo al dispositivo, previamente inoculado el medio de cultivo con células adherentes. El dispositivo comprende uno o más soportes filamentosos estáticos dispuestos de modo que se favorece el desarrollo de cultivos tridimensionales. Los soportes filamentosos se encuentran dispuestos de forma paralela en el interior del dispositivo para cultivo celular tridimensional y fijados a él por sus extremos. Los soportes filamentosos también pueden estar dispuestos en estructuras de soporte que pueden ser apilables y que se fijan al dispositivo de cultivo celular tridimensional formando una o más capas de soportes filamentosos. Los soportes filamentosos pueden haber sido sometidos a un tratamiento de modificación superficial que afecte al modo en que las células se adhieren a los mismos o al modo en que las células se comportan una vez adheridas. El dispositivo para cultivo celular tridimensional puede adoptar diferentes geometrías, pudiendo ser de forma cilíndrica o en forma de prisma entre otras. El método para cultivo celular tridimesional de la presente invención es de aplicación tanto a la producción de células o derivados de estas células, como a la generación de cultivos tridimensionales para el estudio de diferentes aspectos estructurales, metabólicos o de interacción entre diferentes tipos celulares. El método se inicia con el llenado del dispositivo de la presente invención con una suspensión de células adherentes en medio de cultivo. Tras mantener inmóvil el dispositivo y pasado el tiempo en el que las células se adhieren a la superficie de los soportes filamentosos, se retira el medio de cultivo y es reemplazado por medio fresco. El reemplazo del medio de cultivo puede ser realizado de forma continua mediante un sistema de filtrado. La observación de la evolución del cultivo puede ser realizada de forma visual cuando el dispositivo dispone de paredes transparentes o mediante la extracción de los soportes filamentosos cuando su disposición así lo permita. Por último y una vez que el cultivo tridimensional ha alcanzado el tamaño deseado, se inducen comportamientos en las células mediante la adición de agentes químicos. En caso necesario, las células pueden recuperarse para otros fines mediante tratamiento químico, aplicando enzimas u otros agentes químicos, o mediante tratamientos físicos, que alteren las propiedades de las células adheridas y las desprendan de los soportes filamentosos. A continuación, las células se recuperan como una suspensión celular a través del puerto... [Seguir leyendo]

1. Dispositivo para cultivo tridimensional de células adherentes que comprende uno o más soportes filamentosos, caracterizado porque la disposición de dichos soportes filamentosos contiguos es de forma paralela. 2. Dispositivo según la reivindicación 1 caracterizado porque la distancia entre dichos soportes filamentosos contiguos es de al menos 50 micrómetros. 3. Dispositivo según la reivindicación 1 caracterizado porque dichos soportes filamentosos tienen un diámetro máximo de 1000 micrómetros. 4. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque los extremos de dichos soportes filamentosos están inmovilizados por sus extremos a las paredes de dicho dispositivo. 5. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque dichos soportes filamentos se disponen en al menos una estructura de soporte que se fija a dicho dispositivo de cultivo celular. 6. Dispositivo según reivindicación 5 caracterizado porque dichas estructuras de soporte son apilables. 7. Dispositivo según reivindicación 6 caracterizado porque dichas estructuras de soporte se separan por al menos un elemento separador. 8. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque comprende membranas filtrantes que permiten la entrada y salida de medio de cultivo estéril de manera continua. 9. Método para cultivo tridimensional de células adherentes caracterizado porque: a) se llena un dispositivo de cultivo celular según cualquiera de las reivindicaciones anteriores con una suspensión de células adherentes en medio de cultivo. c) se reemplaza el medio de cultivo agotado por las células por medio fresco. d) se analizan las células en crecimiento sobre los soportes filamentosos. e) se inducen comportamientos en las células en cultivo. f) se recuperan las células del cultivo tridimensional. g) se extrae la suspensión celular para su posterior uso en otras aplicaciones. 10. Método para cultivo tridimensional de células adherentes según reivindicación 9 caracterizado porque dicho análisis de las células en crecimiento sobre dichos soportes filamentosos se realiza de forma visual. 11. Método para cultivo tridimensional de células adherentes según reivindicación 9 caracterizado porque dicho análisis se realiza mediante la extracción de dichas estructuras de soporte que contienen dichos soportes filamentosos. 12. Método para cultivo tridimensional de células adherentes según reivindicación 9 caracterizado porque dicha inducción de comportamientos se realiza mediante la adicción de agentes químicos. 13. Método para cultivo tridimensional de células adherentes según reivindicación 9 caracterizado porque dicha inducción de comportamientos se realiza mediante la combinación de estructuras de soporte con células de distinto tipo en un mismo dispositivo. 14. Método para cultivo tridimensional de células adherentes según reivindicación 9 caracterizado porque dicha recuperación se realiza mediante tratamiento químico, enzimático o físico. 7 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA