DERIVADOS DE 9-DITIOCARBOXILATO DE ACRIDANO PARA GENERAR QUIMIOLUMINISCENCIA CON UNA PEROXIDASA.

Derivados de 9-ditiocarboxilato de acridano para generar quimioluminiscencia con una peroxidasa 5 Campo de la invención ES 2 368 509 T3 La presente invención se refiere a compuestos quimioluminiscentes y a composiciones que reaccionan con una peroxidasa y a una peroxidasa para generar quimioluminiscencia. En particular, la presente invención se refiere a composiciones mejoradas que contienen nuevos compuestos de ceten ditioacetal que reaccionan con una 10 peroxidasa y a un peróxido para producir quimioluminiscencia visible. La invención además se refiere a métodos de ensayo para detectar una peroxidasa y para detectar socios de enlace específicos marcados con peroxidasa en inmuno-ensayos, ensayos de sonda de ácido nucleico y otros ensayos de pares de unión específicos. Antecedentes de la invención Las enzimas de peroxidasa tales como la peroxidasa de rábano (HITS) se usan frecuentemente como marcadores en ensayos ligados a enzimas para moléculas biológicas y otros analitos de interés tales como fármacos, hormonas, esteroides y marcadores de cáncer. La detección quimioluminiscente de estas enzimas ofrece un medio seguro, apropiado y sensible para medir la cantidad de enzima de una muestra o la cantidad de analito marcado con enzima 20 o socio de enlace específico marcado para un analito. Se han desarrollado otros esquemas de reacción quimioluminiscentes para cuantificar el nivel particular de enzimas de peroxidasa. a. Sustratos de peroxidasa quimioluminiscentes. Las acilhidrazidas cíclicas con sustitución amino tales como los conocidos luminol e isoluminol reaccionan con H2O2 y un catalizador de peroxidasa (tales como peroxidasa de 25 rábano, HRP) en condiciones básicas con emisión de luz. Se ha usado esta reacción como la base para métodos analíticos para la detección de H2O2 y peroxidasa. Se sabe que los análogos heterocíclicos de luminol tal como 8amino-5-cloro-7-fenilpirido[3,4-d-piridazin-1,4(2H, 3H)diona (M li, et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 193(2), 540­ 5 (1993)); piridazinoquinoxalinonas (patente de EE.UU. Nº 5.324.835) y pirazolo[4,3:5,6]pirido-[2,3-d]pirazindionas con disustitución 1,3 (Y. Tominaga, et al., Tetrahedron Lett., 36, 8641-4 (1995)) reaccionan con una 30 peroxidasa y con peróxido para producir quimioluminiscencia. Otros compuestos de hidrazida que son quimioluminiscentes cuando son oxidados por una peroxidasa y un peróxido son las ftalhidrazidas con sustitución hidroxi (patente de EE.UU. Nº. 5.552.298). Las patentes de EE.UU. Nos. 5.491.072, 5.523.212 y 5.593.845 de los solicitantes divulgan ésteres de ácido N­ 35 alquilacridancarboxílico quimioluminiscentes, tioésteres y sulfonimidas que producen luz tras reacción con un peróxido o una peroxidasa para su uso en la detección de peroxidasas en ensayos. La solicitud de PCT (WO 94/02486) describe la reacción quimioluminiscente de compuestos de espiroacridano con agua oxigenada. Esta reacción se mejora por medio de la adición de peroxidasa de rábano. 40 Varios compuestos de origen biológico, denominados colectivamente luciferinas, son oxidados por peroxidasa (resumidos en L.J. Kricka y G.H.G. Thorpe, en Luminescecen Immunoassay and Molecular Applications, K.Van Dyke and R. Van Dyke, eds., CRC Press, Boca Raton, 1990, pp. 77-98). Cuando no se usa agua oxigenada, la enzima funciona como una oxidasa. 45 Determinados compuestos de fenol producen quimioluminiscencia tras oxidación con una peroxidasa. Como ejemplos, se citan pirogalol-B-1 y purpogalina-B-2 en Kricka y Thorpe, ibid, así como también compuestos de cumarina o de tipo cumarina, umbeliferona y esculina (D. Slawinska, J. Slowinski, J. Biolumin. Chemilumin., 4, 226­ 30 (1989)); floroglucinol B-3. (M. Halmann, et al., Photochem. Photobiol., 30, 165-7 (1979)); y acetaminofen B-4 (K. Schmitt, G. Cliento, Photochem. Photobiol., 51, 719-23 (1990)). Otros compuestos variados publicados para producir quimioluminiscencia leve en presencia de oxígeno o de un 2 ES 2 368 509 T3 peróxido y una peroxidasa son polímeros sintéticos que contienen base de Schiff ((R. Zoulik, et al., Coll. Czech. Chem. Commun. 60, 95-103 (1995)); ácido indol-3-acético en presencia de colorantes de xanteno con o sin agua oxigenada (S. Krylov, A. Chebotareva, FEBS, 324(1), 6-8 (1993); tirosina, triptófano y clorpromazina (M. Nakano, J. Biolumin. Chemilumin. 4, 231-40 (1989)) y MCLA B-8 M (Mitani, et al., J. Biolumin. Chemilumin. 9, 355-61 (1994)) que presentan estructuras respectivas B-5-B-8 como se muestra a continuación. Ninguna de las referencias anteriores divulga la oxidación quimioluminiscente de los compuestos divulgados 10 actualmente por parte de una peroxidasa. b. Reacción de enoles con HRP. Una serie de publicaciones describe la oxidación al aire catalizada por peroxidasa de aldehídos enolizables (H. Gallardo, et al., Biochim. Biophys. Acta, 789, 57-62 (1984); W.J. Baader, et al., Biochem. Ed. 14(4), 190-2- (1986); I. Nantes, et al., Photochem. Photobiol. 63(6), 702-8 (1996)). Se piensa que el 15 sustrato reactivo es la pequeña cantidad de la forma de enol en equilibrio con el aldehído. La reacción del aldehído se encuentra catalizada por fosfato de enol, pero el fosfato de enol no se consume en sí mismo. La referencia muestra que el fosfato de enol no reacciona con una peroxidasa para producir quimioluminiscencia. La transferencia de energía a los aceptores de energía fluorescentes aumentó la emisión de luz (M.T. Grijalba, et al., Photochem. Photobiol., 63(6), 697-701 (1996)). Se usaron aldehídos enmascarados como éteres de enol sililo (Beader, ibid.) o 20 acetatos de enol en ensayos acoplados en los que se desenmascaró el enol en un primera etapa para generar un enol in situ que posteriormente se hizo reaccionar con una peroxidasa para generar quimioluminiscencia (A. Campa, et al., Photochem. Photobiol., 63 (6), 742-5 (1996)). c. Mejoradores de peroxidasa. Se han empleado numerosos mejoradores de peroxidasa con el fin de aumentar la 25 cantidad y duración de la quimioluminiscencia procedente de la reacción de una peroxidasa con sustratos quimioluminiscentes conocidos que incluyen el luminol anteriormente mencionado y los derivados de ácido acridancarboxílico. Estos incluyen derivados de benzotiazol tal como D-luciferina, varios compuestos fenólicos tales como p-yodofenol, p-fenilfenol, naftoles y aminas aromáticas como las recogidas en G. Thorpe, L. Kricka, en Bioluminiscence and Chemiluminiscence, New Perspectives, J. Scholmerich et al., Eds. pp. 199-208 (1987). Otros 30 compuestos que funcionan como mejoradores de la oxidación quimioluminiscente de acilhidrazidas cíclicas con sustitución amino por parte de una peroxidasa incluyen 4-(4-hidroxifenil)-tiazol (M. li, ibid), un grupo de compuestos divulgado en la patente de EE.UU. 555.171.668, 2-hidroxi-9-fluoreno y un grupo de derivados de benzoxazol con sustitución hidroxi como se divulga en la patente de EE.UU. 5.206.149 y determinados compuestos de ácido fenilborónico como se divulga en la patente de EE.UU. 5.629.168. Ninguna de las referencias anteriores divulga la 35 oxidación quimioluminiscente de los presentes compuestos por parte de una peroxidasa sola o con el uso de mejoradores. d. Mejora de las reacciones quimioluminiscentes con peroxidasa por parte de tensioactivos. La mejora de la quimioluminiscencia producida en las reacciones catalizadas por peroxidasa usando tensioactivos poliméricos y 40 monoméricos se conoce en la técnica. La mejora puede tener lugar afectando al resultado de una o más etapas, por ejemplo, aumentando el rendimiento cuántico de fluorescencia del emisor, aumentando el porcentaje de moléculas de producto generadas en el estado excitado, aumentando la fracción de moléculas que experimentan la reacción quimioluminiscente a través de la inhibición de las reacciones secundarias que compiten o favoreciendo la acción del catalizador de enzima. No existe un patrón claro o evidente que se refiera al efecto de los tensioactivos poliméricos y 45 monoméricos sobre las reacciones quimioluminiscentes. Es imposible predecir qué compuestos de tensioactivos, si es que existen, pueden mejorar la quimioluminiscencia de un proceso particular y únicamente se puede determinar a partir de experimentación importante. 3 El tensioactivo polimérico catiónico poli(bromuro de N-etil-4-vinil-piridinio) inhibió completamente la reacción quimioluminiscente de luminol mediante un conjugado de insulina-peroxidasa con carga negativa y disminuyó la quimioluminiscencia en menor medida cuando se usó una enzima nativa (S.B. Vlasenko, et al., J. Biolumin. Chemilumin., 4, 164-176 (1989)). La solicitud de patente japonesa publicada Nº. JP 06.242.111 y la publicación (R. Iwata, et al., Anal. Biochem., 231, 170-4 (1995)) divulgan el uso de un tensioactivo aniónico y leche desnatada en la peroxidación quimioluminiscente de luminol hasta una emisión de fondo menor o... [Seguir leyendo]

en la que R 1 y R 2 se escogen de forma independiente entre grupos alquilo, alquilo sustituido, heteroalquilo, heteroalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, aralquilo y aralquilo sustituido de 1-20 átomos de carbono, cada uno de R 4 a R 11 es de manera independiente un sustituyente que puede contener de 1 a 50 átomos que se escogen entre C, 10 H, N, O, S, P, Si y átomos de halógeno, y R 3 se escoge entre grupos alquilo, alquilo sustituido, heteroalquilo, heteroalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, aralquilo y aralquilo sustituido. 2. El compuesto de la reivindicación 1, en el que al menos uno de R 4 a R 11 se escoge entre alquilo, alcoxi, halógeno, amino o amino sustituido con uno o dos grupos alquilo o arilo y el resto de R 4 a R 11 son hidrógeno. 3. El compuesto de la reivindicación 1, en el que cada R 4 a R es un átomo de hidrógeno. 4. El compuesto de la reivindicación 1, en el que cada R 3 se escoge entre grupos metilo, fenilo, fenilo sustituido, bencilo, bencilo sustituido, 2-naftilo y p-anisilo. 5. El compuesto de la reivindicación 1, que se encuentra sustituido con al menos un grupo Z que confiere solubilidad en agua. 6. El compuesto de la reivindicación 1, en el que al menos R 1 y R 2 se escogen entre alquilo sustituido con un grupo 25 que se escoge entre grupos de sal de sulfonato, grupos de sal de sulfato, grupos de sal de fosfonato, grupos de sal de fosfato, grupo de sal de carboxilato, grupos de sal de amonio y grupos de sal de fosfonio. ES 2 368 509 T3 7. El compuesto de la reivindicación 6, en el que al menos uno de R 1 y R 2 es un grupo alquilo sustituido con un grupo de sal de sulfonato. 8. El compuesto de la reivindicación 6, en el que al menos uno de R 1 y R 2 es un grupo alquilo sustituido con un grupo de sal de fosfato. 9. El compuesto de la reivindicación 6, en el que R 3 se escoge entre grupos fenilo, fenilo sustituido, bencilo y bencilo 35 sustituido. 10. El compuesto de la reivindicación 1, que se escoge entre el grupo 32 ES 2 368 509 T3 33 ES 2 368 509 T3 34 ES 2 368 509 T3 ES 2 368 509 T3 36 11. El compuesto de la reivindicación 10 que presenta la fórmula: 12. El compuesto de la reivindicación 10 que presenta la fórmula: y ES 2 368 509 T3 37 13 El compuesto de la reivindicación 1, en el que R 1 y R 2 se escogen de forma independiente entre grupos alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, aralquilo y aralquilo sustituido de 1-20 átomos de carbono y que cada uno se puede unir de forma independiente a la posición de anillo respectiva más cercana R 4 o R 11 para cerrar un anillo adicional y pueden unirse para formar un anillo de 5 a 30 átomos, y el átomo de nitrógeno se encuentra unido para cerrar un anillo adicional de 5-7 miembros y que tiene la fórmula: 14 El compuesto de la reivindicación 1, en el que al menos uno de los átomos de azufre se une a la posición de anillo respectiva más cercana R 4 o R 11 para formar un anillo de 5 a 7 átomos, y cuando solo uno de los átomos de 10 azufre se une de esta forma, R 1 se escoge entre grupos alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, aralquilo y aralquilo sustituido de 1-20 átomos de carbono y que tienen la fórmula: 15. Un compuesto de fórmula ES 2 368 509 T3 o manera independiente un sustituyente que puede contener de 1 a 50 átomos que se escogen entre C, H, N, O, S, P y átomos de halógeno, R 3 en la que R se escoge entre grupos alquilo, alquilo sustituido, heteroalquilo, heteroalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, aralquilo y aralquilo sustituido, y en la que el compuesto se encuentra sustituido con al menos un grupo Z que confiere solubilidad en agua. 1 y R 2 están unidos por un anillo que comprende de cinco a treinta átomos, cada uno de R 4 a R 11 es de 16. El compuesto de la reivindicación 15, en el que el anillo es un alquileno sustituido o una cadena de heteroalquileno. 17. El compuesto de la reivindicación 15, en el que el grupo R 3 está sustituido con al menos un grupo Z que confiere 25 solubilidad. 18. El compuesto de la reivindicación 15, en el que el anillo que conecta R 1 y R 2 comprende de cinco a siete átomos. 19. El compuesto de la reivindicación 16, en el que R 3 se escoge entre grupos alquilo, heteroalquilo, fenilo y bencilo. 38 20. El compuesto de la reivindicación 15, en el que Z se escoge entre grupos de sal de sulfonato, grupos de sal de sulfato, grupos de sal de fosfonato, grupos de sal de fosfato, grupos de sal de carboxilato, grupos de sal de amonio y grupos de sal de fosfonio. 5 21. El compuesto de la reivindicación 17, en el que Z se escoge entre grupos de sal de sulfonato, grupos de sal de sulfato, grupos de sal de fosfonato, grupos de sal de fosfato, grupos de sal de carboxilato, grupos de sal de amonio y grupos de sal de fosfonio. 22. El compuesto de la reivindicación 15, en el que al menos uno de R 4 a R 11 se escoge entre alquilo, alcoxi, 10 halógeno, amino o amino sustituido con uno o dos grupos alquilo o arilo y el resto de R 4 a R 11 son hidrógeno. ES 2 368 509 T3 23. El compuesto de la reivindicación 15, en el que cada R 4 a R 11 es un átomo de hidrógeno. 24. El compuesto de la reivindicación 15 que se escoge entre el grupo de 25. El compuesto de la reivindicación 24 que presenta la fórmula: 26. El compuesto de la reivindicación 15, en el que R 1 y R 2 están unidos por medio de un anillo que comprende de cinco a treinta átomos condensados con un segundo anillo, y que además comprende un grupo Z que confiere 25 solubilidad en agua. y 27. El compuesto de la reivindicación 26, en el que el segundo anillo condensado es un anillo de benceno o un anillo de benceno sustituido. 30 28. El compuesto de la reivindicación 26, en el que el segundo anillo se encuentra sustituido con al menos un grupo 39 Z que confiere solubilidad en agua. ES 2 368 509 T3 29. El compuesto de la reivindicación 26 que se escoge entre ES 2 368 509 T3 41 ES 2 368 509 T3 42 Intensidad ES 2 368 509 T3 43 Intensidad ES 2 368 509 T3 44 ES 2 368 509 T3 ES 2 368 509 T3 46 ES 2 368 509 T3 47 ES 2 368 509 T3 48