Un conjugado que comprende una zeolita marcada con colorante, un resto de válvula y un agente de unión por afinidad unido covalentemente al mismo

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a formación de imágenes de células biológicas o virus y a cristales de zeolita L modificados para su uso en la formación de imágenes de células o virus y para su uso en diagnósticos in vitro.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Se anticipa que un mayor entendimiento de las funciones y los mecanismos de regulación celulares y virales conducirá a nuevos enfoques para la terapia y nuevos agentes terapéuticos. En consecuencia existe mucho interés en nanoherramientas celulares y virales como un medio de investigar aspectos de la función celular y viral y sus mecanismos. Dahm y col. (Journal of Biochemistry 111:279-290, 2004) describe el uso de partículas de zeolita ultraestables como una herramienta para química intracelular. En particular Dahm y col., describe el uso de partículas de zeolita Y marcadas que se absorbieron en células THP-1 mediante fagocitosis y concluyeron que esas zeolitas podrían usarse como vehículos eficaces para el suministro de moléculas de bajo peso molecular a las células. Las partículas de zeolita se hacen ultraestables mediante la desaluminación de la estructura natural.

Las zeolitas naturales son minerales que son el resultado de un metamorfismo de grado muy bajo, típicamente halladas en las cavidades o vesículas de roca volcánica. Son aluminosilicatos estructurales que consisten en tetraedros entrelazados de SiO4 y AlO4, en los que los tetraedros SiO4 y AlO4 que comparten una esquina del aluminosilicato cristalino dan lugar a canales unidimensionales dispuestos en una estructura hexagonal. Cada entidad de aluminio en su marco contribuye una carga negativa que se compensa mediante un intercambio de cationes tales como sodio, calcio y similares que residen en los grandes espacios vacíos y jaulas de la estructura (véase Breck en Zeolite Molecular Sieves, 752, Wiley, Nueva York, 1974; y Baerlocher y col., en Atlas of Zeolite Framework Types, 19, Elsevier, Amsterdam, 5ª edición, 2001). La estequiometría es (K)9[Al9Si27O72].nH2O, siendo n igual a 21 en materiales completamente hidratados y 16 a una humedad relativa de aproximadamente el 22%. De 9 cationes de potasio por celda unitaria 3,6 pueden intercambiarse por otros cationes monovalentes o una cantidad equivalente de cationes divalentes o trivalentes.

Se conocen muchas formas de zeolita, mostrando cada forma diferentes características geométricas y químicas. Por ejemplo, la zeolita L muestra canales unidimensionales que atraviesan el cristal completo, con una abertura de 0,71 nm, un diámetro libre mayor de 1,26 nm y una longitud de celda unitaria de 0,75 nm (véase figura Ia). La distancia centro a centro entre dos canales es de 1,84 nm. Por ejemplo un cristal con un diámetro de 550 nm consiste en aproximadamente 80.000 canales paralelos. Los canales de zeolita L pueden llenarse con moléculas incluidas orgánicas adecuadas, aunque sólo pueden entrar en los canales las moléculas incluidas que pueden pasar a través de la abertura. Debido a las entradas de los canales, las propiedades químicas y físicas de la base y el revestimiento de los cristales cilíndricos son diferentes. Las moléculas incluidas ejemplares incluyen ciertos colorantes que poseen propiedades de emisión deseadas (véase Calzaferri y col., Angew Chem Int Ed 42:3732, 2003). Los cristales de zeolita L también pueden prepararse en diferentes tamaños (diámetro y longitud). Por ejemplo la longitud de un cristal de zeolita L puede ser de 30 nm a varios miles de nanómetros (véase Ruiz y col., Monatshefte Fur Chemie 136:77, 2005). Se han sintetizado previamente cristales de zeolita L pura con longitudes entre 30 y 7000 nm (Megelski y Calzaferri, Adv Funct Mater 11:277, 2001).

Se describen zeolitas cargadas de colorante en la patente Europea número 1 335 879 (Universidad de Berna). Esta patente enseña la carga de un colorante en los canales interiores de un cristal de zeolita L. Las entradas a los canales se terminan o bloquean mediante una molécula de cierre, especialmente mediante un denominado resto de válvula. Las enseñanzas de este documento de patente se refieren a la construcción de un dispositivo óptico luminiscente, un dispositivo sensor óptico, un dispositivo emisor de luz y un dispositivo de recogida de energía fotónica.

Se sabe que las entradas de canal de un cristal de zeolita L pueden bloquearse o cerrarse mediante una molécula de cierre. Dicha molécula de cierre puede modificarse químicamente para portar por ejemplo un grupo amino (véase Huber y col., Angew Chem Int Ed 43:6738, 2004) o un grupo carboxilato (H. Li, Z. Popovic, L. De Cola, G. Calzaferri, Micr Mes Mat, 95:112, 2006). En este proceso preferentemente una molécula de válvula, es decir, una molécula que tiene un grupo funcional y una cola, que comprende por ejemplo un grupo de anclaje hidrófilo y un espaciador, entra parcialmente en un canal del cristal de zeolita L. El grupo de anclaje tal como metoxisilano y el espaciador entran en el canal permitiendo al grupo de anclaje unirse al cristal de zeolita L. El grupo funcional masivo, por ejemplo un grupo de fluorenilmetilcarbamato permanece fuera de la entrada del canal debido a la restricción de tamaño impuesta por las dimensiones del canal. Dependiendo de la reactividad del marcador, la unión al cristal puede ser reversible o irreversible. El grupo funcional se separa después químicamente para por ejemplo dar como resultado un grupo amino funcional al final de un canal.

Gran parte del trabajo en zeolitas hasta la fecha ha sido en el uso de los cristales de zeolita en aplicaciones fotónicas (como se indica en la patente de la Universidad de Berna). Los inventores de la presente solicitud se han dado cuenta, sin embargo, de que las zeolitas se usan en ensayos diagnósticos para diagnósticos tanto in vivo como in vitro. Los inventores se han dado cuenta de que es posible unir un agente de unión por afinidad por ejemplo mediante el resto de válvula a un conjugado. Comprendiendo dicho conjugado un agente de unión por afinidad en condiciones apropiadas se unirá a otro resto biológico o resto químico. El colorante cargado en los canales o en la parte exterior de las zeolitas permite la detección simple del conjugado unido al resto biológico o al resto químico.

El documento WO 2004/025268A (Universidad Carnegie Melon) desvela un biosensor para la detección de analitos biológicos o ambientales, comprendiendo dicho biosensor un componente de selectividad para el reconocimiento de una molécula diana (por ejemplo un agente de unión por afinidad) y una molécula indicadora que es sensible a cambios en el microambiente (por ejemplo un colorante fluorescente). El biosensor puede inmovilizarse en una superficie del sustrato (por ejemplo zeolita). El agente de unión por afinidad, sin embargo, no se une al conjugado mediante un resto de válvula. DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La figura 1 muestra a) una imagen de microscopía electrónica de barrido (MEB) de un cristal de zeolita L y (dentro del círculo) una representación esquemática de un cristal que indica que múltiples canales estrictamente paralelos están contenidos dentro de cada cristal, junto con una representación esquemática de una sección transversal longitudinal de un canal único; b) una sección transversal esquemática de un canal único dentro del cristal de zeolita L funcionalizado con bifenil terpiridina de acuerdo con la invención. La imagen de microscopía óptica mostrada sobre la representación esquemática muestra emisión débil, apareciendo los cristales como objetos únicos desordenados o agregados desordenados grandes; c) una sección transversal esquemática de un canal único dentro de dos cristales de zeolita L separados, cada uno funcionalizado con bifenil terpiridina tras la adición de ZnCl2. Los grupos de bifenil terpiridina han quelado un ión de zinc, uniéndose de este modo al cristal de modo que el canal está alineado en una disposición de acuerdo con la invención. La imagen de microscopía óptica mostrada sobre la representación esquemática muestra una emisión muy intensa en la región azul y la formación de disposiciones de zeolita lineal; d) una representación esquemática de un marco de los canales con una abertura de 0,71 nm y una simetría hexagonal; y e) una representación esquemática de una vista lateral de un canal que contiene una molécula colorante. La doble flecha indica la orientación de un momento de transición electrónica del colorante.

La figura 2 muestra a) una molécula de bifenil terpiridina (bitpy); b) dos moléculas de

2+ 2+

bitpy que quelan un ión metálico Zn(Zn(bitpy)2 2(PF6),...

1. Un conjugado que comprende una zeolita marcada con colorante, un resto de válvula y un agente de unión por afinidad unido covalentemente al mismo.

2. El conjugado de la reivindicación 1, en el que el agente de unión por afinidad se une a una molécula de válvula.

3. El conjugado de la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho agente de unión por afinidad se selecciona del grupo que consiste en antígeno y anticuerpo, biotina o análogo de biotina y avidina o estreptavidina, azúcar y lectina, ácido nucleico o análogo de ácido nucleico y ácido nucleico complementario y receptor y ligando.

4. El conjugado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho agente de unión por afinidad es un antígeno o un anticuerpo.

5. El conjugado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el colorante usado para marcar la zeolita se selecciona del grupo que consiste en un compuesto luminiscente; un compuesto fluorescente; un compuesto absorbente de luz; un compuesto radiactivo que puede visualizarse mediante placas fotográficas, un compuesto metálico que puede visualizarse usando rayos x; un compuesto que puede visualizarse usando formación de imágenes por resonancia magnética (IRM); un isótopo que puede visualizarse mediante tomografía axial computerizada (TAC), ultrasonidos o tomografía de emisión de positrones (PET).

6. El conjugado de la reivindicación 5, en el que dicho colorante se selecciona del grupo que consiste en un compuesto luminiscente; un compuesto fluorescente; y un compuesto radiactivo.

7. El conjugado de la reivindicación 5, en el que dicho colorante es un colorante que puede visualizarse mediante IRM, TAC o PET.

8. Un procedimiento para producir un conjugado de acuerdo con la reivindicación 1

comprendiendo el procedimiento las etapas de: a) marcar una zeolita con un colorante b) cerrar los canales de la zeolita marcada con colorante mediante una molécula de válvula c) añadir un agente de unión por afinidad y d) usar una química de acoplamiento apropiada para formar un enlace covalente entre la zeolita marcada con colorante con molécula de válvula y el agente de unión por afinidad.

9. Uso de un conjugado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en un procedimiento de diagnóstico.

10. Un procedimiento para medir un analito mediante un procedimiento in vitro,

comprendiendo el procedimiento las etapas de a) proporcionar una muestra que se sospecha o se sabe que comprende el analito b) poner en contacto dicha muestra con un conjugado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en condiciones apropiadas para la formación de un complejo de analito conjugado, c) medir el complejo formado en la etapa (b) y obtener de este modo una medida del analito.

11. Una zeolita marcada cargada con un colorante visualizable, en la que el colorante visualizable se selecciona del grupo que consiste en un compuesto metálico que puede visualizarse usando rayos x; un compuesto que puede visualizarse usando imagen de resonancia magnética (IRM); un isótopo que puede visualizarse mediante tomografía axial computerizada (TAC), ultrasonidos o tomografía por emisión de positrones (PET).

12. La zeolita marcada de acuerdo con la reivindicación 11, en la que dicho colorante es un colorante que puede visualizarse mediante IRM, TAC o SPECT.

13. La zeolita marcada de acuerdo con las reivindicaciones 11 ó 12, siendo la zeolita zeolita

L.