Un procedimiento in vitro para producir una célula, que comprende introducir un ARN que comprende la secuencia de nucleótidos correspondiente a la región entera del ARN genómico de la cepa JFH-1 en una célula,

en el que la célula resultante replica dicho ARN y produce una partícula de virus, en el que dicho ARN tiene capacidad replicativa autónoma y capacidad de producción de partículas de virus.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un procedimiento para producir una célula , a un procedimiento in vitro para producir partículas del virus de la hepatitis C y a un procedimiento in vitro para replicar y/o expresar un gen extraño en una célula. Además, la presente invención también se refiere a un procedimiento in vitro para producir un vector vírico que comprende un gen extraño.

Antecedentes de la técnica

El virus de la hepatitis C (VHC) pertenece a la familia Flaviviridae y es un virus que tiene un genoma de ARN de sentido directo (+) de cadena única y es conocido por producir la hepatitis C.

El VHC produce hepatitis crónica por infección persistente. Actualmente, la principal causa de hepatitis crónica observada mundialmente es la infección persistente por VHC. De hecho, alrededor del 50% de individuos con infección persistente desarrolla hepatitis crónica. La hepatitis crónica en aproximadamente un 20% de estos pacientes evoluciona a cirrosis hepática en el curso de 10 a 20 años, y algunos de estos pacientes experimentan adicionalmente condiciones patológicas letales avanzadas tales como cáncer hepático.

La hepatitis C se trata actualmente principalmente mediante terapia usando interferón-α o interferón-β, o una terapia que usa una combinación de interferón-α y ribavirina, un derivado nucleósido de purina. Sin embargo incluso cuando se llevan a cabo estas terapias, se observan efectos terapéuticos en solo un 60 % de los pacientes tratados. Cuando cesan las terapias después que se observan los efectos, se recrudece la enfermedad en más de la mitad de los pacientes.

Es una importante meta desarrollar agentes terapéuticos o agentes profilácticos eficaces contra la hepatitis C. La tasa de incidencia de la hepatitis C, que produce finalmente graves consecuencias, es elevada en países industrializados, y no está actualmente disponible un tratamiento causal. Por tanto, se desea el desarrollo de quimioterapias y terapias de vacunas específicas de VHC. Un objetivo para el desarrollo de un agente dirigido contra el VHC puede ser la supresión de la replicación de VHC o la supresión de la infección de las células con VHC.

Recientemente, se han preparado sistemas de replicones de ARN subgenómico de VHC, en forma de ARN replicable autónomamente derivado de VHC (véanse, los Documentos de Patente 1, 2 y 3, los Documentos No de Patente 1-4). En los sistemas de replicones de ARN subgenómico de VHC, el replicón de ARN de VHC en el que se eliminan y sustituyen los genes estructurales del genoma de VHC con un gen marcador seleccionable de fármaco, se prepara e introduce en células cultivadas, y por tanto, el replicón de ARN se replica autónomamente en las células. Usando estos sistemas llega a ser posible analizar el mecanismo de replicación de VHC. Sin embargo, este es un sistema experimental en el que únicamente se evalúa la replicación del ARN vírico en el proceso de la proliferación y la replicación del virus VHC, y no se puede analizar el proceso de formación de las partículas del virus VHC en las células infectadas y la liberación extracelular de la infección en otras células.

En la actualidad, se puede evaluar únicamente el proceso de formación de partículas del virus VHC y la liberación extracelular así como la infección en otras células en los sistemas experimentales que usan animales tales como chimpancés (Documento No de Patente 5). Sin embargo, los sistemas experimentales que usan organismos vivos tales como animales son complicados y muy difíciles de analizar. Por tanto, con el fin de analizar el proceso de formación de partículas del virus VHC y la liberación extracelular, así como la infección en otras células, y para producir un agente dirigido contra VHC que tendrá el mecanismo de acción de inhibir este proceso, es necesario establecer un sistema experimental muy simplificado que reproduzca este proceso, es decir, un sistema de producción de partículas del virus VHC en sistemas experimentales de cultivo celular.

Adicionalmente, una vez que se pueden proporcionar de manera estable partículas del virus VHC usando el sistema de cultivo celular, es posible atenuar el virus o producir virus VHC no infeccioso usando técnicas de biología molecular, y se pueden usar éstas en vacunas.

Documento de Patente 1: Publicación de patente japonesa (kokai) Nº 2001-17187

Documento de Patente 2: Solicitud de Patente Internacional PCT/JP03/15038

Documento de Patente 3: Solicitud de Patente japonesa Nº 2003-329082

Documento No de Patente 1: Lohmann y col., Science, (1999) 285, p. 110-113

Documento No de Patente 2: Blight y col., Science, (2000) 290, p 1972-1974

Documento No de Patente 3: Friebe y col., J. Virol., (2001) 75(24): p. 12047-12057 Documento No de Patente 4: Ikeda y col., Science, (1977) 277, p. 2997-3006

Documento No de Patente 5: Kolykhalov y col., Science, (1977) 277, p. 570-574

Documento No de Patente 6: Kato y col., Gastroenterology, (2003) 125, p. 1808-1817

Documento No de Patente 7: Yanagi y col., Proc. Natl. Acad. Sci., (1997) 96(16): p. 8738-8743

Documento No de Patente 8: Okamoto y col., J. Gen. Virol. (1991) 73, p. 2697-26704

Documento No de Patente 9: Aoyagi y col., J. Clin. Microbiol., (1999) 37(6); p. 1802-1808

Divulgación de la invención

El objetivo de la presente invención es proporcionar un procedimiento para replicar eficazmente el ARN que contiene las secuencias genómicas del VHC de longitud completa y un procedimiento para producir partículas del virus VHC que contengan el replicón de ARN del VHC de longitud completa o el ARN genómico del VHC de longitud completa en un sistema de cultivo celular. El objetivo de la presente invención no se ha conseguido nunca hasta el momento.

Como resultado de intensos estudios para conseguir el anterior objeto, los presentes inventores han desarrollado un procedimiento para producir partículas del virus VHC en un sistema de cultivo celular. Esto es, la presente invención es como se indica a continuación.

[1] Un procedimiento in vitro para producir una célula que comprende introducir un ARN que comprende la secuencia de nucleótidos correspondiente a la región entera del ARN genómica de la cepa JFH-1 dentro de una célula, en el que la célula resultante replica dicho ARN y produce una partícula vírica, en el que dicho ARN tiene capacidad de replicación autónoma y capacidad de producción de partículas víricas.

[2] Un procedimiento in vitro para producir una partícula del virus de la hepatitis C, que comprende introducir un ARN que comprende la secuencia de nucleótidos correspondiente a la región entera del ARN genómico de la cepa JHF-1 dentro de una célula y cultivar la célula para permitir que la célula produzca una partícula vírica, en el que dicho ARN tiene capacidad de replicación autónoma y capacidad de producción de partículas víricas.

[3] Un procedimiento para cribar una sustancia dirigida contra el virus de la hepatitis C que comprende producir una célula de acuerdo con el procedimiento de [1], cultivar la célula en presencia de una sustancia de ensayo, y detectar el replicón de ARN o las partículas víricas en el cultivo resultante.

[4] Un procedimiento para cribar una sustancia dirigida contra el virus de la hepatitis C que comprende producir una partícula del virus de la hepatitis C acuerdo con el procedimiento de [2], cultivar la partícula del virus de la hepatitis C y una célula permisiva con el virus de la hepatitis C en presencia de una sustancia de ensayo, y detectar el replicón de ARN o las partículas víricas en el cultivo resultante.

[5] Un procedimiento in vitro para replicar y/o expresar un gen extraño en una célula, que comprende introducir un ARN que comprende la secuencia de nucleótidos correspondiente con la región entera del ARN genómico de la cepa JFH-1 y que contiene la secuencia de ARN que codifica el gen extraño, estando ligada la secuencia de ARN que codifica el gen extraño a un marco de lectura correctos aguas abajo de la región 5' no traducida o aguas arriba de la región 3' no traducida, o estando insertada en un sitio entre la secuencia de codificación de la proteína núcleo, la secuencia de codificación de la proteína E1, la secuencia de codificación de la proteína E2, la secuencia de codificación de la proteína... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento in vitro para producir una célula, que comprende introducir un ARN que comprende la secuencia de nucleótidos correspondiente a la región entera del ARN genómico de la cepa JFH-1 en una célula, en el que la célula resultante replica dicho ARN y produce una partícula de virus, en el que dicho ARN tiene capacidad replicativa autónoma y capacidad de producción de partículas de virus.

2. Un procedimiento in vitro para producir una partícula del virus de la hepatitis C, que comprende introducir un ARN que comprende la secuencia de nucleótidos correspondiente a la región entera del ARN genómico de la cepa JFH1 en una célula y cultivar la célula para permitir que la célula produzca una partícula de virus, en el que dicho ARN tiene capacidad replicativa autónoma y capacidad de producción de partículas de virus.

3. Un procedimiento para cribar una sustancia contra el virus de la hepatitis C, que comprende producir una célula de acuerdo con el procedimiento de la reivindicación 1, cultivar la célula en presencia de una sustancia de ensayo y detectar el replicón de ARN o las partículas de virus en el cultivo resultante.

4. Un procedimiento para cribar una sustancia contra el virus de la hepatitis C, que comprende producir una partícula del virus de la hepatitis C de acuerdo con el procedimiento de la reivindicación 2, cultivar la partícula del virus de la hepatitis C y una célula permisiva al virus de la hepatitis C en presencia de una sustancia de ensayo y detectar el replicón de ARN o las partículas de virus en el cultivo resultante.

5. Un procedimiento in vitro para replicar y/o expresar un gen extraño en una célula, que comprende introducir un ARN que comprende la secuencia de nucleótidos correspondiente a la región entera del ARN genómico de la cepa JFH-1 y que contiene la secuencia de ARN de codificación del gen extraño, la secuencia de codificación del gen extraño estando ligada a un marco de lectura correcto aguas debajo de la región 5' no traducida o aguas arriba de la región 3' no traducida o estando insertada en un emplazamiento entre la secuencia de codificación de la proteína núcleo, la secuencia de codificación de la proteína E1, la secuencia de codificación de la proteína E2, la secuencia de codificación de la proteína NS2, la secuencia de codificación de la proteína NS3, la secuencia de codificación de la proteína NS4A, la secuencia de codificación de la proteína NS4B, la secuencia de codificación de la proteína NSSA, la secuencia de codificación de la proteína NSSB, en una célula, en el que dicho ARN tiene capacidad replicativa autónoma y capacidad de producción de partículas de virus.

6. Un procedimiento in vitro para producir un vector vírico que comprende un gen extraño, que comprende introducir un ARN que comprende la secuencia de nucleótidos correspondiente a la región entera del ARN genómico de la cepa JFH-1 y que contiene la secuencia de ARN de codificación del gen extraño, la secuencia de codificación del gen extraño estando ligada a un marco de lectura correcto aguas debajo de la región 5' no traducida o aguas arriba de la región 3' no traducida o estando insertada en un emplazamiento entre la secuencia de codificación de la proteína núcleo, la secuencia de codificación de la proteína E1, la secuencia de codificación de la proteína E2, la secuencia de codificación de la proteína NS2, la secuencia de codificación de la proteína NS3, la secuencia de codificación de la proteína NS4A, la secuencia de codificación de la proteína NS4B, la secuencia de codificación de la proteína NSSA, la secuencia de codificación de la proteína NSSB, en una célula, en el que dicho ARN tiene capacidad replicativa autónoma y capacidad de producción de partículas de virus.

7. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la región entera del ARN genómico de la cepa JFH-1 comprende la región 5' no traducida de SEC DE ID Nº: 1, la secuencia de codificación de la proteína núcleo de SEC DE ID Nº: 2, la secuencia de codificación de la proteína E1 que de SEC DE ID Nº: 3, la secuencia de codificación de la proteína E2 de SEC DE ID Nº: 4, la secuencia de codificación de la proteína NS2 de SEC DE ID Nº: 5, la secuencia de codificación de la proteína NS3 de SEC DE ID Nº: la secuencia de codificación de la proteína NS4A de SEC DE ID Nº: 7, la secuencia de codificación de la proteína NS4B de SEC DE ID Nº: 8, la secuencia de codificación de la proteína NSSA de SEC DE ID Nº: 9, la secuencia de codificación de la proteína NSSB de SEC DE ID Nº: 10, la región 3' no traducida de SEC DE ID Nº: 11.

8. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la célula es una célula derivada de hígado humano, una célula derivada de cuello uterino humano o una célula derivada de riñón fetal humano.

9. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que célula es una célula Huh7, una célula HepG2, una célula IMY-N9, una célula HeLa o una célula 293.