CONJUGADOS PEPTÍDICOS MODIFICADOS EN LOS EXTREMOS N Y/O C CON CADENAS PÉPTIDICAS CORTAS CARGADAS.

Conjugados peptídicos modificados en los extremos N y/o C con cadenas peptídicas cortas cargadas [0001] La presente invención se refiere a nuevos conjugados peptídicos con actividades farmacológicas interesantes, a un procedimiento para la preparación de los nuevos conjugados peptídicos, a composiciones farmacéuticas que contienen los conjugados peptídicos y al uso de los conjugados peptídicos para la preparación de un medicamento. ANTECEDENTES [0002] El péptido endógeno de tipo opioide nociceptina (también denominado orfanina FQ) se describió primeramente en el sistema nervioso central y la mayor parte de la investigación en este campo se ha centrado en los efectos en el SNC. La nociceptina se une a un receptor específico, denominado receptor similar a receptores de opioides uno (ORL1) con mucha mayor afinidad que a los tres subtipos clásicos de receptores de opioides. Los efectos de la nociceptina en el SNC incluyen: hiperalgesia/hipoalgesia, estimulación del apetito y punzadas, aumento (en dosis bajas) o disminución (en dosis altas) de la locomoción, trastornos del aprendizaje y disforia. Sin embargo, la nociceptina también ejerce efectos importantes fuera del SNC. Así, dosis bajas de nociceptina aumentan la excreción renal de agua y disminuyen la excreción urinaria de sodio (es decir, produce una diuresis acuosa selectiva), lo que hace que este compuesto sea interesante para el tratamiento de la hiponatremia (Daniel R. Kapusta, Life Science, 60: 15-21, 1997) (patente de los EE. UU. n° 5.840.696). Si se administra por vía central (i.c.v.) o por vía periférica a dosis altas (bolos o infusión i.v.), la nociceptina disminuye la presión sanguínea, la frecuencia cardíaca y la actividad nerviosa simpática periférica. [0003] Dooley y col. (The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 283(2): 735-741, 1997) han demostrado que un hexapéptido cargado positivamente con la secuencia de aminoácidos Ac-RYY(RK)(WI)(RK)­ NH2, en la que los paréntesis muestran la variación permitida de restos aminoacídicos, actúa como agonista parcial del receptor de la nociceptina ORL1. Dicho hexapéptido se identificó a partir de una biblioteca combinatoria de péptidos y la secuencia es única, sin homología ni similitud con el heptadecapéptido nociceptina. Sin embargo, dicho hexapéptido es demasiado inestable para producir un medicamento satisfactorio. [0004] El documento WO 99/44627 desvela el uso de hexapéptidos, incluidos los hexapéptidos descubiertos por Dooley y col. para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de las afecciones siguientes: migraña, diabetes del tipo II, choque séptico, inflamaciones y trastornos vasomotores. Se demuestra que el hexapéptido Ac-Arg-Tyr-Tyr-Arg-Trp-Lys-NH2 inhibe la respuesta depresora a la estimulación de la médula espinal. [0005] El documento WO 99/46283 expone el uso de una secuencia peptídica flanqueante de 4-20 restos aminoacídicos para la estabilización de péptidos farmacológicamente activos contra la hidrólisis enzimática. Los péptidos estabilizantes preferidos son secuencias de polilisina cargadas positivamente y la nociceptina se menciona entre los péptidos activos que se estabilizan de este modo contra la hidrólisis enzimática. [0006] Considerando que se espera que los agonistas de ORL1, incluido el hexapéptido descubierto por Dooley y col., así como los verdaderos análogos de nociceptina, tengan graves efectos secundarios en el SNC si se exponen al cerebro, lo que se observa a niveles de dosificación mayores que los requeridos para provocar diuresis acuosa en ratas, un objetivo principal de la presente invención es proporcionar nuevos conjugados peptídicos con la actividad de tipo nociceptina de dicho hexapéptido o con actividad de unión al receptor ORL1, pero que actúen selectivamente fuera del SNC. Otro objeto de la presente invención es proporcionar nuevos conjugados peptídicos con la actividad de tipo nociceptina de dicho hexapéptido o con actividad de unión al receptor ORL1 y con mejor estabilidad. Además, es un objeto de la invención proporcionar nuevos conjugados peptídicos con la actividad de tipo nociceptina de dicho hexapéptido o con actividad de unión al receptor ORL1 y/o a un receptor todavía sin identificar en el tejido renal. [0007] Este objetivo se consigue con los conjugados peptídicos de la presente invención que comprenden hexapéptidos modificados en los extremos C y/o N por conjugación con cadenas peptídicas cargadas cortas. SUMARIO DE LA INVENCIÓN ES 2 365 501 T3 [0008] Un conjugado peptídico de la fórmula general I R1-Z-X-Z-R2 2 (I) en la que X representa un hexapéptido con la secuencia de la fórmula (II) (RK) YY (RK)(WI)(RK), en que los paréntesis indican alternativas; Z representa una cadena peptídica cargada de 4 a 20 restos aminoacídicos con la configuración D o L 5 o está ausente; y Z representa una cadena peptídica cargada de 4 a 20 restos aminoacídicos con la configuración D o L o está ausente, teniendo en cuenta que Z y Z no estén ausentes a la vez; R1 representa H o un grupo acilo; R2 representa NR3R4, en que cada uno de R3 y R4, representan independientemente hidrógeno, alcoxi 10 C(1-6), ariloxi o un alquilo inferior según se define en este documento; o R2 representa OH; y sales, hidratos y solvatos del mismo y derivados del mismo esterificados en el extremo C con ácidos orgánicos o inorgánicos adecuados. [0009] Los conjugados peptídicos de la invención pueden formar sales de adición de ácido, preferentemente con ácidos farmacéuticamente aceptables y estas sales están incluidas dentro del alcance de la invención. Los compuestos pueden servir como medicamentos en su forma pura. Sin embargo, preferentemente los compuestos se incorporan en formulaciones médicas sólidas o líquidas, que incluyen comprimidos, cápsulas, disoluciones y suspensiones. Otros componentes de tales formulaciones pueden incluir un vehículo, un diluyente, un agente tamponante, un agente osmótico y un conservante. Las formulaciones sólidas son particularmente adecuadas para la administración por vía oral, mientras que las disoluciones son más útiles para inyección (i.v., i.m., i.p. o s.c.) o para administración por vía intranasal. [0010] Los conjugados peptídicos de la invención con actividad de tipo nociceptina o actividad de unión al receptor ORL1, pero que actúan fuera del SNC son especialmente útiles en el tratamiento de enfermedades y dolencias periféricas relacionadas con ORL1, como las enfermedades en las que se requiere o prefiere un efecto renal selectivo. Más específicamente, los conjugados peptídicos de la invención muestran un efecto acuarético significativo ahorrador de sodio y de potasio, que es beneficioso en el tratamiento de afecciones patológicas formadoras de edemas asociadas con hiponatremia y/o hipopotasemia. Los conjugados peptídicos de la invención son útiles para el tratamiento médico de humanos y para uso veterinario como diuréticos durante estados formadores de edemas en ganado, por ejemplo equino y vacuno. Una ventaja particular de los compuestos de la invención es su estabilidad en el plasma en comparación con los hexapéptidos desvelados por Dooley y col. [1] [0011] Los nuevos conjugados peptídicos de la invención son útiles para la preparación de anticuerpos capaces de unirse específicamente a dichos conjugados peptídicos. Los anticuerpos producidos contra los conjugados peptídicos de la invención o fracciones de los mismos también se desvelan. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS ES 2 365 501 T3 [0012] La figura 1 muestra curvas de respuesta a la concentración para los efectos de la adición acumulativa de las sustancias de prueba (Ac-RYYRWK-NH2 y el compuesto 1) sobre la relajación inducida por nociceptina en el ensayo del conducto deferente de ratón. La figura 2 muestra las respuestas cardiovascular y renal a nociceptina administrada como infusión i.v. (11 nmol/kg/min); HR es la frecuencia cardíaca (latidos por minuto, lpm), MAP significa la presión arterial (mm de Hg), V es la tasa de flujo urinario (µl/min) y UNaV es la tasa de excreción urinaria de sodio (µeq/min). La figura 3 muestra las respuestas cardiovascular y renal al compuesto 1 administrado como infusión i.v. (1 y 0,1 nmol/kg/min), así como la actividad nerviosa simpática renal como porcentaje del nivel de control (RNSA, %). La figura 4 muestra la disminución del aclaramiento osmolar (COsm) y el aumento del aclaramiento de agua libre (CH2O) observados durante la infusión i.v. del compuesto 1 (1 y 0,1 nmol/kg/min). La figura 5 ilustra la magnitud similar de los cambios de las respuestas cardiovascular y renal (V y UNaV) provocadas por la infusión i.v. de 1 nmol/kg/min del compuesto 1 y 11 nmol/kg/min de nociceptina. La figura 6 ilustra la magnitud similar de los cambios de las respuestas cardiovascular y... [Seguir leyendo]

1. Un conjugado peptídico de la fórmula general I R1-Z-X-ZR2 X representa un hexapéptido con la secuencia aminoacídica (RK)YY(RK)(WI)(RK), en la que los restos aminoacídicos alternativos en las posiciones 1, 4, 5 y 6 se muestran entre paréntesis y en la que cada resto aminoacídico en dicho hexapéptido puede estar en la forma L o D; Z representa una cadena peptídica cargada de 4 a 20 restos aminoacídicos con la configuración D o L o está ausente; y Z representa una cadena peptídica cargada de 4 a 20 restos aminoacídicos con la configuración D o L o está ausente, teniendo en cuenta que Z y Z no estén ausentes a la vez; R1 representa H o un grupo acilo; ES 2 365 501 T3 R2 representa NR3R4, en que cada uno de R3 y R4 representan independientemente hidrógeno, alcoxi C(1-6), ariloxi o alquilo; o R2 representa OH; en que los conjugados peptídicos de la fórmula I pueden estar ligados opcionalmente a una fracción de transporte; o una sal, hidrato o solvato del mismo o un derivado del mismo esterificado en el extremo C con un ácido orgánico o inorgánico adecuado. 2. Un conjugado peptídico según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que el número de restos aminoacídicos en Z y Z está en el intervalo de 5 a 10. 3. Un conjugado peptídico según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que los restos aminoacídicos en Z y Z presentan la configuración L. 4. Un conjugado peptídico según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que los restos aminoacídicos de Z se seleccionan del grupo que consta de Q, T, S, P, N, E y D. 5. Un conjugado peptídico según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que el aminoácido N-terminal de Z se selecciona del grupo que consta de Q, T, N y S y los restos aminoacídicos restantes se seleccionan del grupo que consta de P, D y E. 6. Un conjugado peptídico según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que Z se selecciona del grupo que consta de N(E)7, N(E)6, N(E)5, N(E)3, S(E)7, S(E)6, S(E)5, S(E)3, NP(E)4, NP(E)5, N(D)7, N(D)6, N(D)5, N(D)3, Q(E)7, Q(E)5, Q(E)3, QN(D)7, Q(D)6, C(D)5, y Q(D)3. 7. Un conjugado peptídico según la reivindicación 1 con la fórmula general III R1-ZR2 (III). 8. Un conjugado peptídico según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes ligado además a una fracción de transporte, en que dicha fracción de transporte se selecciona preferentemente del grupo que consta de los restos 49-57 del péptido tat del VIH, los restos 49-56 del péptido tat del VIH, la secuencia tat YGRKKRRQRRR, un péptido de poliarginina con 6 a 20 restos, como R6 y secuencias de péptidos transductores, como las secuencias peptídicas siguientes YARKARRQARR, YARAAARQARA, YARAARRAARR, YARAARRAARA, YARRRRRRRRR y YAAARRRRRRR. 9. Un conjugado peptídico según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que Z representa una cadena peptídica cargada positivamente. 10. Un conjugado peptídico según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que R1 representa acetilo o trifluoroacetilo. 11. Un conjugado peptídico según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que R2 representa NH2 o R2 representa NR3R4, en que cada uno de R3 y R4 representan de manera independiente hidrógeno, metilo o etilo. 33 (I) 5 13 Un conjugado peptídico según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que dicho hexapéptido X es KYYRWK o RYYRWK. ES 2 365 501 T3 12. Un conjugado peptídico según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que dicho hexapéptido X se selecciona del grupo que consta de KYYRWK, RYYRWR, RYYRWK, RYYRWK (todos D), RYYRIK, RYYRIR, RYYKIK, RYYKIR, RYYKWR y RYYKWK. 14. Un conjugado peptídico según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que los restos aminoacídicos de Z se seleccionan del grupo que consta de A, G, K, H y R, preferentemente K. 15. Un conjugado peptídico según la reivindicación precedente, en que Z se selecciona del grupo que consta de A(K4)G, K5G, AK5, K10, K9, K8, K7, K6, K5 y K4. 16. Un conjugado peptídico según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende además un resto de cisteína terminal. 17. Un conjugado peptídico según la reivindicación 1 seleccionado del grupo que consta de compuesto 1: Ac-RYYRWKKKKKKK-NH2 compuesto 2: Ac-KKKKKKRYYRWK-NH2 compuesto 3. H-NEEEEERYYRWKKKKKKK-NH2 compuesto 8: Ac-RYYRWKKKKKKK-NH2 (todos D) compuesto 9: Ac-KYYRWKKKKKKK-NH2 compuesto 10: Ac-RYYRIKKKKKKK-NH2 compuesto 11: Ac-RYYRWKAKKKKK-NH2 compuesto 12: Ac-RYYRWKKKKKK-NH2 compuesto 13: Ac-RYYRWKKKKKKKC-NH2 compuesto 14: Tfa-RYYRWKKKKKKK-NH2 el ácido libre C-terminal del mismo, derivados esterificados del mismo y sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables del mismo. 18. Un conjugado peptídico según la reivindicación 17, que es el compuesto 1A: Ac-RYYRWKKKKKKK­ NH2 x 9 CH3COOH o el compuesto 1C: Ac-FtYYRWKKKKKKK-NH2 x 9 HCl. 19. Un conjugado peptídico X-Z seleccionado del grupo que consta de RYYRWKAK5, KYYRWKK6, RYYRWKK6, RYYRWRK6, RYYRIKK6 y RYYRWK6 o una sal farmacéuticamente aceptable o un derivado acetilado en el extremo N o amidado o esterificado en el extremo C del mismo. 20. Un conjugado peptídico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 que es Ac-RYYRWKK6­ NH2 (compuesto 1) o una sal, hidrato o solvato del mismo. 21. Una sustancia biológicamente activa que comprende un conjugado peptídico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 que está cargado positivamente y un contraión cargado negativamente seleccionado del grupo que consta de aniones farmacéuticamente aceptables, preferentemente CH3COO - , CF3COO - , Cl - , SO3 2- , maleato y oleato. 22. Una composición farmacéutica que comprende como compuesto activo un conjugado peptídico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 o una sustancia activa según se define en la reivindicación 21 y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. 23. Una composición farmacéutica según la reivindicación 22 que comprende además un vehículo líquido seleccionado del grupo que consta de jarabe, aceite de cacahuete, aceite de oliva, fosfolípidos, ácidos grasos, aminas de ácido graso, polioxietileno y agua para la administración por vía parenteral. 24. Una composición farmacéutica según la reivindicación 22 o la reivindicación 23 que contiene en una dosis unitaria una cantidad de dicho conjugado peptídico en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 mg. 25. Una composición farmacéutica según la reivindicación 22 en una forma adaptada para la administración solo por vía periférica. 34 26. Un conjugado peptídico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20 o una sustancia biológicamente activa según la reivindicación 21 para el uso en un procedimiento de tratamiento médico. 27. Uso de un conjugado peptídico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20 o una sustancia biológica según la reivindicación 21 para la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de hiponatremia o hipopotasemia. 28. Uso según la reivindicación 27, en que dicha hiponatremia o hipopotasemia está asociada con insuficiencia cardíaca. 29. Uso según la reivindicación 28, en que dicha hiponatremia o hipopotasemia está asociada con un tratamiento diurético intensivo con tiazidas y/o diuréticos del asa. 30. Uso de un conjugado peptídico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20 o una sustancia biológicamente activa según la reivindicación 21 para la preparación de un medicamento para la diuresis acuosa selectiva. 31. Uso de un conjugado peptídico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20 o una sustancia biológicamente activa según la reivindicación 21 para la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de una afección con retención de agua, como insuficiencia cardíaca congestiva, cirrosis hepática, síndrome nefrótico e hipertensión. 32. Uso de un conjugado peptídico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20 o una sustancia biológicamente activa según la reivindicación 21 para la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de la insuficiencia orgánica múltiple. 33. Uso de un conjugado peptídico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20 o una sustancia biológicamente activa según la reivindicación 21 para la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de la insuficiencia renal aguda. 34. Uso de un conjugado peptídico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20 o una sustancia biológicamente activa según la reivindicación 21 para la preparación de un medicamento para el uso en el tratamiento de estados patológicos asociados con una elevada actividad de nociceptina. 35. Uso de un conjugado peptídico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20 o una sustancia biológicamente activa según la reivindicación 21 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de edemas, opcionalmente en combinación con un diurético. 36. Uso según la reivindicación 35, en que el edema está asociado con insuficiencia cardíaca coronaria. 37. Uso según la reivindicación 35, en que dicho diurético es un diurético del asa. 38. Una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia polipeptídica que comprende la secuencia peptídica de la fórmula I o III. 39. Una célula hospedadora recombinante que comprende la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 38 y es capaz de expresar dicha secuencia polipeptídica. 40. Un procedimiento para la producción de un conjugado peptídico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20 con una secuencia polipeptídica natural que comprende: la introducción de una secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 38 y un marcador seleccionable, contenidos dentro de una construcción de ácido nucleico o un vector, en una célula hospedadora para obtener una célula hospedadora recombinante; la selección de dicha célula hospedadora recombinante; ES 2 365 501 T3 el cultivo de dichas células hospedadoras recombinantes en condiciones que permitan la producción de dicha secuencia polipeptídica; el aislamiento de dicha secuencia polipeptídica del cultivo; ES 2 365 501 T3 opcionalmente la escisión de dicha secuencia polipeptídica mediante una proteasa adecuada para obtener dicho conjugado peptídico. 41. Un procedimiento para sintetizar un conjugado peptídico según una cualquiera de las reivindicaciones 5 1 a 20 por medio de técnicas de síntesis peptídica en fase de disolución o en fase sólida. 42. Un procedimiento para mejorar la estabilidad en el plasma sanguíneo de un hexapéptido con la secuencia (RK)YY(RK)(WI)(RK), en la que los restos aminoacídicos alternativos en las posiciones 1, 4, 5 y 6 se muestran entre paréntesis y en que cada resto aminoacídico en dicho hexapéptido puede estar en la forma L o D; en 10 que el procedimiento comprende la ligación de una secuencia peptídica Z por medio de un enlace peptídico al extremo C de dicho hexapéptido para formar un péptido conjugado, en que Z representa una cadena peptídica cargada con 4 a 20 restos aminoacídicos en la configuración D o L y en que dicho procedimiento no se realiza in vivo. 15 43. Un procedimiento según la reivindicación 42, en que dicha secuencia Z se selecciona del grupo que consta de secuencias K5, K6 y K5C sin ramificar. 36 ES 2 365 501 T3 37 ES 2 365 501 T3 38 ES 2 365 501 T3 39 ES 2 365 501 T3 ES 2 365 501 T3 41 ES 2 365 501 T3 42 ES 2 365 501 T3 43 ES 2 365 501 T3 44 ES 2 365 501 T3 ES 2 365 501 T3 46