Un procedimiento para elaborar un conjugado de insulina-oligómero en una reacción en un solo reactor que comprende las etapas de a) transpeptidación de un precursor de insulina para producir un éster de insulina,

b) mezclar dicho éster de insulina en tampón de borato con un oligómero solubilizado en acetonitrilo, para alcanzar simultáneamente el desbloqueo de dicho éster de insulina y la conjugación de disco éster de insulina a dicho oligómero en un solo reactor, c) obtener un conjugado de insulina-oligómero

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere a un procedimiento para elaborar un conjugado de insulina-oligómero como una reacción en un solo reactor mediante la conjugación de un éster de insulina con un oligómero activado en la que se llevan a cabo desbloqueo y conjugación simultáneos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las células β de los islotes pancreáticos secretan un precursor monocatenario de insulina, conocido como proinsulina, que durante la proteólisis da como resultado el polipéptido biológicamente activo insulina. La molécula de insulina está altamente conservada a través de las especies y consiste generalmente en dos cadenas de aminoácidos conectadas por enlaces disulfuro. La molécula de insulina humana natural (pm 5.807 daltons) tiene una cadena A de 21 residuos de aminoácido con glicina en el extremo amino; y una cadena B de 30 residuos de aminoácido con fenilalanina en el extremo amino. La insulina puede existir como un monómero o puede agregarse en un dímero o un hexámero formado por tres de los dímeros. El monómero tiene la capacidad de unirse a receptores y es la forma biológicamente activa.

El polipéptido de insulina es la principal hormona responsable de controlar el transporte, la utilización y el almacenamiento de glucosa en el cuerpo. Un defecto en el metabolismo de los carbohidratos como resultado de la producción insuficiente de insulina o la sensibilidad reducida del receptor a insulina conduce al trastorno biológico diabetes. La diabetes impide la capacidad normal para usar la glucosa y como resultado incrementa los niveles de azúcar en sangre (hiperglucemia). A medida que la glucosa se acumula en la sangre, niveles excesivos de azúcar se secretan en la orina (glicosuria). Otros síntomas de la diabetes incluyen volumen y frecuencia urinarios incrementados, sed, picazón, hambre, pérdida de peso y debilidad. La diabetes, cuando no se trata, conduce a cetosis, seguida por acidosis con náuseas y vómitos. A medida que los productos tóxicos continúan acumulándose, el paciente entra en coma diabético, lo que conduce a la muerte del paciente. Existen dos tipos de diabetes -la Tipo I es la diabetes mellitus insulinodependiente o IDDM: la IDDM se denominó primeramente “diabetes de comienzo juvenil”. En la IDDM, la insulina no es secretada por el páncreas y debe proporcionarse a partir de una fuente externa. La diabetes Tipo II o de comienzo adulto puede controlarse normalmente mediante la dieta, aunque en algunos casos avanzados se requiere insulina.

Banting et ál divulgan el uso de insulina para el tratamiento de la diabetes usando un extracto activo procedente del páncreas de perros diabéticos "Pancreatic Extracts in the Treatment of Diabetes Mellitus" (Can. Med. Assoc. J., 12:141-146 (1922). En el mismo año, el tratamiento de un paciente diabético con extractos pancreáticos dio como resultado una drástica mejora clínica que salva vidas.

Tradicionalmente, se usaron casi exclusivamente insulina bovina y porcina para tratar la diabetes en seres humanos. Con el desarrollo de la tecnología recombinante, la fabricación a escala comercial de insulina humana se hizo posible mediante fermentación. Por otra parte, análogos de insulina genéticamente manipulados que tenían una actividad biológica comparable a la de la insulina humana natural se desarrollaron para combatir la enfermedad.

Sin embargo, el tratamiento de la diabetes requiere típicamente inyecciones regulares de insulina. Debido a la incomodidad de las inyecciones de insulina, se han probado diversos sistemas para formular insulina para la administración mediante rutas no inyectables. Una lista de tales divulgaciones incluye: US 4.338.306 (Kitao et ál.) divulga composiciones farmacéuticas de insulina y ácidos grasos que tienen de 8 a 14 átomos de carbono y sales atóxicas de los mismos para administración rectal de insulina; US 4.579.730 (Kidron et ál) divulga composiciones de insulina revestidas entéricamente con un ácido biliar o una sal de metal alcalino del mismo para la administración oral de insulina; US 5.283.236 (Chiou et ál.) divulga una composición de insulina con un agente que mejora la penetración para ayudar a la absorción sistémica de polipéptidos de peso molecular superior, así como inhibidores de peptidasa para el aporte sistémico de insulina a través de los ojos, en donde el fármaco pasa al conducto nasolacrimal y se absorbe en la circulación; US 5.658.878 (Backstrom et ál.) divulga una insulina y sal sódica de un ácido graso saturado de una longitud de la cadena de carbonos 10 (es decir, caprato sódico), 12 (laurato sódico) o 14 (miristato sódico) que mejora la absorción de insulina en el tracto respiratorio inferior; US 5.853.748 (New et ál.) divulga una composición revestida entéricamente de insulina, una sal biliar o un ácido biliar e iones carbonato o bicarbonato, usados para ajustar el pH del intestino hasta un pH de 7,5 a 9, para la administración oral de insulina. US 6.200.602 (Watts et ál) divulga una composición de aporte de fármacos de insulina para el aporte colónico de insulina con un promotor de la absorción que incluye una mezcla de ácidos grasos que tienen de 6 a 16 átomos de carbono y sus sales o una mezcla de mono/diglicéridos de ácidos grasos de cadena media junto con un agente

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dispersante, en un revestimiento para prevenir la liberación de insulina y el promotor de la absorción hasta que el comprimido, la cápsula o la pella alcance el colon proximal.

Se han realizado intentos de aportar insulina mediante administración oral. Los problemas asociados con la administración oral de insulina para alcanzar euglucemia en pacientes diabéticos están bien documentados en la bibliografía farmacéutica y médica. Las enzimas digestivas del tracto GI degradan rápidamente la insulina, dando como resultado productos de descomposición biológicamente inactivos. En el estómago, por ejemplo, la insulina administrada oralmente sufre proteolisis enzimática y degradación ácida. La supervivencia en el intestino está impedida por una proteolisis excesiva. En la luz, la insulina es detenida por una variedad de enzimas, incluyendo enzimas gástricas y pancreáticas, exo-y endopeptidasas y peptidasas de borde en cepillo. Incluso si la insulina sobrevive a este ataque enzimático, las barreras biológicas que deben atravesarse antes de que la insulina pueda alcanzar sus receptores in vivo pueden limitar la administración oral de insulina. Por ejemplo, la insulina puede poseer baja permeabilidad de membranas, limitando su capacidad para pasar de la luz a la corriente sanguínea.

Polipéptidos farmacéuticamente activos tales como insulina se han conjugado con mezclas polidispersadas de polietilenglicol o mezclas polidispersadas de polímeros que contienen polietilenglicol, para proporcionar mezclas polidispersadas de conjugados de fármaco-oligómero; US 4.179.337 (Davis et ál) divulga conjugar polipéptidos tales como insulina con diversos polietilenglicoles tales como MPEG-1900 y MPEG-5000 suministrados por Union Carbide. US 5.567.422 (Greenwald) divulga la conjugación de nucleófilos biológicamente activos con polietilenglicoles tales como m-PEG-OH (Union Carbide), que tiene un peso molecular medio en número de 5.000 daltons.

La conjugación de polipéptidos tales como insulina con polímeros glicolipídicos modificados con polietilenglicol y polímeros de ácido graso modificados con polietilenglicol se divulgan en US 5.359.030 (Ekwuribe et ál).

US 6.011.008 (Domb et ál.) divulga un método para producir un conjugado con polisacárido soluble en agua de una sustancia sensible a la oxidación que comprende activar el polisacárido hasta un dialdehído mediante oxidación con peryodato; (b) purificar el dialdehído de iones y subproductos interferentes; y (c) acoplar la sustancia al dialdehído purificado mediante formación de una base de Schiff para formar el conjugado. Opcionalmente, el conjugado de la etapa (c) se reduce hasta un conjugado de amina mediante una sustancia reductora. La insulina se conjugó a AG (arabinogalactano) oxidado a través de un enlace amínico o imínico al hacer reaccionar una solución de AG (arabinogalactano) oxidado puro en solución tamponadora de borato a pH 8,9 con insulina a 4°C durante la noche. La solución transparente se dializó a través de una diálisis con celulosa y la solución se liofilizó para dar 115 mg de un sólido blanco.

US 6.022.524 (Maisano et ál): Gd-DTPA se conjugó con insulina porcina en una solución de DTPA y dimetilsulfóxido... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para elaborar un conjugado de insulina-oligómero en una reacción en un solo reactor que comprende las etapas de

a) transpeptidación de un precursor de insulina para producir un éster de insulina,

b) mezclar dicho éster de insulina en tampón de borato con un oligómero solubilizado en acetonitrilo, para alcanzar simultáneamente el desbloqueo de dicho éster de insulina y la conjugación de disco éster de insulina a dicho oligómero en un solo reactor,

c) obtener un conjugado de insulina-oligómero.

2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además purificar dicho precursor de insulina mediante cromatografía y precipitación, antes de someter a dicho precursor a transpeptidación.

3. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que se incrementa el pH de la mezcla.

4. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el pH se incrementa hasta aproximadamente 11.

5. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el precursor de insulina es proinsulina o miniproinsulina.

6. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el oligómero es un alquil-PEG o un derivado del mismo.

7. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el alquil-PEG tiene la fórmula general -OC-(CH2)n-(OCH2CH2)n-OCH3.

8. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el oligómero se activa antes de la conjugación.

9. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el oligómero activado usado para la conjugación es C14H23NO8.

10. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el conjugado de insulina-oligómero es conjugado de insulina B29 Nε-oligómero.

11. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, en el que the conjugado de insulina-alquil-PEG es conjugado de insulina B29 Nε-alquil-PEG.

12. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el conjugado es insulina B29 Nε-OC-CH2-CH2-(OCH2CH2)3-OCH3.