Conjugado de administración ósea que tiene la estructura: Z-sALP-Y-Dn-X,

en la que X está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido; Y está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido; Z está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido; Dn es un poliaspartato en el que n = 10 a 16; y sALP es una fosfatasa alcalina soluble

Campo de la invención

La presente invención se refiere a conjugados de administración ósea y a un método de uso de los mismos para dirigir proteínas a hueso. Más específicamente, la presente invención se refiere a composiciones de administración ósea que comprenden motivos peptídicos, diseñados por ingeniería genética dentro de la estructura de una proteína mediante tecnología de ADN recombinante para promover la unión a la matriz ósea.

Antecedentes de la invención

Los avances tecnológicos en biología molecular, producción de proteínas recombinantes y purificación de proteínas a gran escala han permitido la producción de grandes cantidades de proteínas usadas ahora como productos biofarmacéuticos. Por ejemplo, se han usado anticuerpos monoclonales y formas solubles del receptor de TNF- en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias tales como enfermedad de Crohn o formas graves de psoriasis (1). Otro ejemplo de uso de una proteína recombinante es la terapia de sustitución enzimática (TSE). La TSE se ha usado para tratar enfermedades de almacenamiento lisosomal. Este grupo de trastornos genéticos se caracteriza por la pérdida de la función de enzimas de lisosomas dando como resultado patologías somáticas, y algunas veces neuronales, graves. En la TSE para estas enfermedades, se infunden a los pacientes grandes dosis de enzimas normales. Estas enzimas infundidas se internalizan entonces a partir de la circulación por medio de receptores de superficie celular (receptor de manosa-6-fosfato) y entran en la ruta endocítica o siguen su camino hasta su sitio de acción, el lisosoma. No todos los intentos de tratar trastornos genéticos mediante TSE han sido satisfactorios.

La hipofosfatasia es un tipo de raquitismo u osteomalacia hereditario, poco común que se produce con una incidencia de 1 por 100.000 nacimientos para la forma más grave de la enfermedad. Formas más leves son más prevalentes. En este defecto metabólico congénito, mutaciones inactivan el gen que codifica para la isoenzima no específica de tejido de la fosfatasa alcalina. Se caracteriza bioquímicamente por actividad fosfatasa alcalina en suero inferior a la normal. La deficiencia en fosfatasa alcalina en osteoblastos y condrocitos altera la mineralización esquelética, conduciendo a raquitismo u osteomalacia.

Existe una gama muy amplia de expresividad de la hipofosfatasia, que abarca desde una forma perinatal que provoca a menudo muerte fetal debido a un esqueleto no mineralizado, hasta una forma más leve que se caracteriza sólo por pérdida prematura de los dientes. Los niños y lactantes afectados de manera grave heredan la hipofosfatasia como un rasgo recesivo autosómico. Existen cuatro formas principales de la enfermedad: perinatal, del lactante, infantil y adulta. La hipofosfatasia perinatal se manifiesta durante la gestación y la mayoría de los recién nacidos afectados sólo sobreviven brevemente. La hipofosfatasia del lactante se hace clínicamente evidente antes de los 6 meses de edad. Aproximadamente el 50% de los pacientes mueren en el plazo de un año. La gravedad de la hipofosfatasia infantil varía enormemente aunque la mayoría de estos pacientes padecerán síntomas esqueléticos a lo largo de toda su vida. La hipofosfatasia adulta aparece durante la mediana edad, con síntomas tales como fracturas por sobrecarga recurrentes dolorosas que tienen una mala curación.

Los osteoblastos y condrocitos son normalmente ricos en fosfatasa alcalina no específica de tejido, en los que está unida a la superficie celular. En la hipofosfatasia, la falta de actividad fosfatasa alcalina da como resultado la acumulación extracelular de tres compuestos de fósforo que se cree que son sustratos de la enzima: fosfoetanolamina (PEA), pirofosfato inorgánico (PPi) y piridoxal-5'-fosfato (PLP). PPi es un inhibidor del crecimiento de cristales de hidroxiapatita, y la acumulación de PPi en la enfermedad explica la mineralización esquelética alterada. En consecuencia, proporcionar una enzima activa a pacientes que padecen hipofosfatasia disminuirá los niveles de PPi extracelulares y mejorará la mineralización esquelética.

Actualmente, no existe ninguna terapia médica establecida para la hipofosfatasia. Los ensayos de sustitución enzimática usando infusiones intravenosas de fosfatasa alcalina no han tenido éxito. Parece que la actividad fosfatasa alcalina debe aumentarse no en la circulación sino en el propio esqueleto. Esta hipótesis se confirmó recientemente mediante trasplante de médula ósea. Desafortunadamente, los beneficios del trasplante duraron sólo un corto periodo de tiempo debido a un mal injerto.

Existe por tanto una necesidad de proporcionar un enfoque de terapia de sustitución enzimática para proporcionar enzima activa al esqueleto de pacientes que padecen hipofosfatasia.

Las proteínas dirigidas al hueso podrían ser útiles no sólo para el tratamiento o la prevención de la hipofosfatasia (pérdida de función de la fosfatasa alcalina) sino también para el tratamiento o la prevención de otras enfermedades genéticas caracterizadas por actividad enzimática defectuosa implicada en el metabolismo óseo, tal como raquitismo hipofosfatémico ligado al cromosoma X (XLH) (pérdida de función del gen que regula el fosfato con homología con endopeptidasas en el cromosoma X (PHEX)).

**(Ver fórmula)**

XLH es la más prevalente de las hipofosfatemias familiares (OMIM 307800, 307810). Se caracteriza por reducción de la recaptación de fosfato en el riñón, hipofosfatemia, normocalcemia, niveles de 1,25-dihidroxi-vitamina D3 (1,25(OH)2D, calcitriol) de normales a bajos, función normal de la glándula paratiroidea y actividad fosfatasa alcalina plasmática elevada. Estos cambios están asociados con retraso del crecimiento, deformidad de las extremidades inferiores, pruebas radiológicas e histomorfológicas de raquitismo y osteomalacia. Esta enfermedad parece resultar de defectos renales combinados en la reabsorción de fosfato tubular y el metabolismo de la vitamina D, así como un trastorno funcional en los huesos y los dientes. XLH resulta de mutaciones inactivantes en el gen PHEX, un miembro de la familia de metalopeptidasas de zinc de glicoproteínas de membrana integrales de tipo II. Estas mutaciones impiden la expresión de una enzima PHEX funcional en la superficie celular de osteoblastos. Por ahora, el tratamiento de pacientes con XLH se restringe a complementación con complementos de fosfato inorgánico oral (Pi) en cuatro o cinco dosis divididas al día, y coadministración de 1,25(OH)2D para compensar la síntesis inapropiada de 1,25(OH)2D. Tales altas dosis de fosfato provocan frecuentemente intolerancias gastrointestinales, particularmente diarrea, que conducen a incumplimiento por parte del paciente. Por un lado, la carga de fosfato conlleva el riesgo de provocar hiperparatiroidismo secundario (que puede ser lo suficientemente grave como para necesitar paratiroidectomía) mientras que por otro lado, la administración de 1,25(OH)2D en exceso puede conducir a hipercalciuria, hipercalcemia y nefrocalcinosis.

Por tanto, una TSE útil para XLH buscará sustituir la enzima PHEX defectuosa en pacientes con XLH por una enzima funcional obtenida a través de tecnología de ADN recombinante. Puesto que la enzima PHEX normal está anclada en la membrana plasmática de osteoblastos mediante un péptido hidrófobo, la forma natural de PHEX no puede producirse y purificarse en cantidades suficientes para usarse en una preparación farmacéutica. Para sortear el problema, se diseñó por ingeniería genética una forma soluble de PHEX recombinante (o sPHEX) y se produjo en cultivos celulares, se purificó y se formuló para su administración intravenosa (i.v.) (documento WO00/50580). Entonces se inyectó sPHEX en ratones Hyp, un modelo de ratón para XLH, tal como se describe en la solicitud estadounidense en tramitación junto con la presente n.º 10/362.259. Se observó una mejora de varios parámetros séricos relacionados con el hueso incluyendo una reducción de los niveles anómalamente altos de fosfatasa alcalina sérica. Aunque estos experimentos fueron satisfactorios, se creía que la eficacia de sPHEX terapéutica podía potenciarse si se modificase la proteína recombinante de modo que se estimulase su unión a minerales del hueso.

Existe por tanto una necesidad de medios para dirigir de manera satisfactoria proteínas a la matriz ósea.

Se sabe que los bisfosfonatos presentan unión de alta afinidad a hidroxiapatita (HA), y se han usado para dirigir moléculas pequeñas (4) y proteínas (5) a huesos. Sin embargo,... [Seguir leyendo]

1. Conjugado de administración ósea que tiene la estructura:

Z-sALP-Y-Dn-X, en la que X está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido; Y está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido; Z está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido; Dn es un poliaspartato en el que n = 10 a 16; y sALP es una fosfatasa alcalina soluble.

2. Conjugado de administración ósea según la reivindicación 1, en el que la sALP contiene todos los aminoácidos de la forma anclada activa de fosfatasa alcalina (ALP).

3. Conjugado de administración ósea según la reivindicación 1, en el que la sALP está codificada por la secuencia tal como se expone en SEQ ID NO: 5.

4. Conjugado de administración ósea según la reivindicación 1, en el que la sALP consiste en la secuencia tal como se expone en SEQ ID NO: 6.

5. Conjugado de administración ósea según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que n = 10.

6. Composición de administración ósea que comprende el conjugado de administración ósea según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, y un portador farmacéuticamente aceptable.

7. Uso del conjugado de administración ósea según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para administrar una proteína a tejido óseo de un mamífero in vitro.

8. Conjugado de administración ósea según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para su uso como medicamento.

9. Uso del conjugado de administración ósea según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la fabricación de un medicamento para tratar un estado o enfermedad relacionada con un defecto óseo caracterizado por una falta de, o una cantidad insuficiente de, fosfatasa alcalina funcional, estando dicho conjugado en un portador farmacéuticamente aceptable.

10. Uso según la reivindicación 9, en el que el estado o enfermedad es hipofosfatasia.

11. Conjugado de administración ósea según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para su uso en un método para tratar un estado o enfermedad relacionada con un defecto óseo caracterizado por una falta de,

o una cantidad insuficiente de, fosfatasa alcalina funcional, estando dicho conjugado en un portador farmacéuticamente aceptable.

12. Conjugado de administración ósea según la reivindicación 11, en el que el estado o enfermedad es hipofosfatasia.