Un complejo aislado que comprende una proteína SIRT1 de mamífero y una proteína LXR de mamífero

Antecedentes de la invención

La homeostasis del colesterol se mantiene mediante el equilibrio entre la ingesta con la dieta, la síntesis de nuevo colesterol, el transporte, el metabolismo y la excreción. Niveles bajos de lipoproteína de elevada densidad (HDL, del inglés “high density lipoprotein”) y niveles altos de lipoproteína de baja densidad (LDL, del inglés “low density lipoprotein”) se asocian a hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia y un aumento del riesgo de enfermedad cardiovascular1 y enfermedad de Alzheimer2-6, las enfermedades asociadas a la edad que son causas principales de mortalidad en la población de media edad y de edad avanzada. Tanto los factores genéticos como los ambientales contribuyen a la progresión de la enfermedad cardiovascular y la enfermedad de Alzheimer, y el riesgo de estos trastornos aumenta con la edad. Sin embargo, se sabe poco de los mecanismos subyacentes a través de los cuales los factores genéticos son sensibles al entorno ambiental para mediar en estas enfermedades asociadas al envejecimiento.

El regulador de información silencioso 2 (Sir2) es un regulador crítico de la esperanza de vida como respuesta a cambios ambientales. El gen Sir2 es un determinante de longevidad en levadura, C. elegans7 y Drosophila 8,9. Tanto en levadura 10,11 como en Drosophila 8,9, también se requiere la actividad Sir2 para la extensión de la esperanza de vida proporcionada por la restricción calórica. Bioquímicamente, la Sir2 y sus homólogos (sirtuínas) son un grupo de desacetilasas de proteína dependientes de NAD+ altamente conservadas 12-14. El requerimiento de NAD+ puede hacer que las sirtuinas monitoricen el metabolismo celular y modulen los procesos celulares que afectan al envejecimiento. En mamíferos, la SIRT1, un ortólogo de mamífero de la proteína Sir2, tiene múltiples sustratos de proteína y es capaz de regular procesos relacionados con el envejecimiento, tal como el ciclo celular, la apoptosis, la respuesta al estrés oxidativo y neurodegeneración 15-20. En estos procesos, la SIRT1 es capaz de desplazar el equilibrio entre muerte celular y supervivencia celular, proporcionando de este modo resistencia al estrés 21.

El metabolismo del colesterol y de la grasa está regulado por muchos factores ambientales y celulares comunes. Los Receptores Activados por Proliferador de Peroxisoma (PPARs, del inglés “Peroxisome Proliferator-Activated Receptors”) y los Receptores X Hepáticos (LXRs, del inglés “Liver X Receptors”), dos subclases de receptores nucleares sensibles a péptidos, desempeñan funciones críticas en el metabolismo de lípidos y carbohidratos. Estudios recientes han demostrado que en el tejido de grasa blanca, la SIRT1 interactúa con el receptor nuclear PPARγ a través de co-represor de receptor nuclear (N-CoR) y promueve la movilización de grasas tras privación alimentaria 22. La SIRT1 también es capaz de interactuar y modificar el coactivador PPARγ PGC-1α para regular la homeostasis hepática de glucosa 23,24. La Patente de EE.UU. 6.048.903 muestra que el nivel de lipoproteínas de densidad pesada (HDL) en la sangre de un sujeto humano puede facilitarse mediante la administración de transresveratrol al sujeto, y que dicha sustancia reduce el nivel de lipoproteínas de densidad ligera (LDL) en la sangre del sujeto. La implicación de la SIRT1 en el metabolismo de grasas y en la homeostasis de glucosa demuestra el potencial de que esta proteína también podría regular la homeostasis de colesterol en mamíferos. La presente invención estudia estos nuevos mecanismos de homeostasis de colesterol.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere de forma general a composiciones y métodos útiles en el campo de la homeostasis de colesterol y el transporte de colesterol inverso.

En un primer aspecto, la invención proporciona un complejo aislado que contiene una proteína SIRT1 de mamífero y una proteína LXR de mamífero. En determinadas realizaciones este complejo contiene adicionalmente un elemento de respuesta de LXR.

En un aspecto relacionado, la invención proporciona un método para formar un complejo que contiene una proteína

45 SIRT1 de mamífero y una proteína LXR de mamífero. El método incluye la combinación de composiciones que contienen una proteína SIRT1 de mamífero, una proteína LXR de mamífero y un fragmento de un ácido nucleico celular que incluye un elemento de respuesta de LXR.

En otro aspecto adicional, la invención proporciona un método para identificar un agente que modula la formación de un complejo que comprende una proteína SIRT1 de mamífero y una proteína LXR de mamífero. Este método incluye las etapas de:

 combinar composiciones que contienen una proteína SIRT1 de mamífero, una proteína LXR de mamífero y un fragmento de un ácido nucleico celular que incluye un elemento de respuesta de LXR, proporcionando de este modo una composición de complejo;

 adicionalmente poner en contacto una de las composiciones que contiene la proteína SIRT1 de mamífero, la composición que contiene la proteína LXR de mamífero, o la composición que contiene el fragmento de ácido nucleico celular con una cuarta composición que incluye el agente antes de la etapa de combinación, o poner en contacto la composición de complejo con la cuarta composición que incluye el agente después de la etapa de combinación; y

 determinar si la formación del complejo está modulada por el agente.

En determinadas realizaciones de este método, el agente aumenta la formación del complejo. En realizaciones adicionales, la determinación se lleva a cabo mediante comparación con una composición de control que contiene el agente.

La Patente de EE. UU. 6.835.563 se refiere a polipéptidos ABC1 y a métodos para aumentar el eflujo de colesterol. El documento US2005/136429 describe la evaluación de una molécula de SIRT1 en un sujeto.

También se describe un método para aumentar la relación de colesterol ligado a lipoproteína de alta densidad (HDL) respecto al colesterol total en el plasma de un mamífero, en donde el método incluye la administración al mamífero de un agente que estimula la actividad de SIRT1. Por ejemplo, el agente incluye T0901317.

También se describe un método para aumentar la relación de colesterol ligado a lipoproteína de alta densidad (HDL) respecto al colesterol total en el plasma de un mamífero, en donde el método incluye la administración al mamífero de un agente que promueve la formación de un complejo que contiene una proteína SIRT1 de mamífero y una proteína LXR de mamífero. Por ejemplo, el agente incluye 22(R)-hidroxicolesterol o ácido 9-cis retinoico, o ambos.

También se describe un método para promover el eflujo de colesterol mediado por ABCA1 desde una célula de mamífero, en donde el método incluye la introducción en la célula de un ácido nucleico que contiene una secuencia que codifica una proteína desacetilasa. Por ejemplo, la proteína desacetilasa es una Sir2 ecuariótica o una SIRT1 de mamífero. Otros ejemplos de este método incluyen una etapa adicional de poner en contacto la célula con un agente que estimula la actividad de SIRT1, tal como T0901317. La célula se puede poner en contacto adicionalmente con un agente que promueve la formación de un complejo que contiene una proteína SIRT1 de mamífero y una proteína LXR de mamífero. Por ejemplo, el complejo que promueve incluye 22(R)-hidroxicolesterol o ácido 9-cis retinoico, o ambos.

También se describe un método para tratar a un sujeto que se considera que tiene un nivel de actividad de SIRT1 que está por debajo de lo normal. Dicho sujeto exhibe un nivel de colesterol HDL, y una relación de colesterol HDL a colesterol LDL, que se consideran por debajo de lo normal. El método incluye la administración de un ácido nucleico que codifica SIRT1 específica de especie a un sujeto, en donde el ácido nucleico es efectivo para expresar una cantidad terapéuticamente efectiva de SIRT1 en una célula del sujeto.

También se describe un método para determinar si una sustancia candidata modula un proceso dependiente de LXR. El método incluye la transfección de una célula con un plásmido que alberga un gen indicador dirigido operativamente por un LXRE; poner en contacto la célula con el candidato; y determinar si el candidato modula la expresión del gen indicador en comparación con una célula que no esté en contacto con el candidato; de tal modo que una... [Seguir leyendo]

1. Un complejo aislado que comprende una proteína SIRT1 de mamífero y una proteína LXR de mamífero.

2. El complejo descrito en la reivindicación 1 que además comprende un elemento de respuesta de LXR.

3. Un método para formar un complejo que comprende una proteína SIRT1 de mamífero y una proteína LXR de mamífero, método que comprende combinar una primera composición que comprende una proteína SIRT1 de mamífero, una segunda composición que comprende una proteína LXR de mamífero y una tercera composición que comprende un fragmento de un ácido nucleico celular que incluye un elemento de respuesta de LXR.

4. Un método para identificar un agente que modula la formación de un complejo que comprende una proteína SIRT1 de mamífero y una proteína LXR de mamífero, método que comprende a) combinar una primera composición que comprende una proteína SIRT1 de mamífero, una segunda composición que comprende una proteína LXR de mamífero y una tercera composición que comprende un fragmento de un ácido nucleico celular que incluye un elemento de respuesta de LXR para proporcionar una composición de complejo; b) adicionalmente i) poner en contacto la primera composición, la segunda composición o la tercera composición con una cuarta composición que comprende el agente antes de la etapa de combinación, o ii) poner en contacto la composición de complejo con la cuarta composición que comprende el agente después de la etapa de combinación; proporcionando de este modo una composición de ensayo, y c) determinar si la formación del complejo es modulada por el agente.

5. El método descrito en la reivindicación 4, en el que el agente incrementa la formación del complejo.

6. El método descrito en la reivindicación 4, en el que la determinación además comprende d) combinar la primera composición que incluye una proteína SIRT1 de mamífero, la segunda composición que incluye una proteína LXR de mamífero, y la tercera composición que comprende un fragmento de un ácido nucleico celular que incluye un elemento de respuesta a LXR (LXRE) para proporcionar una composición de control que no incluye al agente, y e) determinar si la formación del complejo en la composición de ensayo está modulada en comparación con la formación del complejo en la composición de control.

7. Un método para determinar si una sustancia candidata modula un efecto dependiente de SIRT1 de una LXR, que comprende

a) transfectar una célula con un vector que alberga un gen SIRT1;

b) transfectar adicionalmente la célula con un vector que alberga un gen informador dirigido operativamente por un promotor de LXRE;

c) poner en contacto la célula con el candidato; y

d) determinar si el candidato modula la expresión del gen informador en comparación con una célula que no se haya puesto en contacto con el candidato; de tal modo que una diferencia en la extensión del efecto dependiente de SIRT1 de la LXR detectada entre la presencia y la ausencia del candidato indica que el candidato modula el efecto dependiente de SIRT1 de una LXR.

8. Un método para determinar si una sustancia candidata modula la formación de un par de unión específica que comprende los miembros de par de unión específica SIRT1 y LXR, que comprende

a) transfectar una célula con un vector que albergue una secuencia que codifique un primer miembro del par de unión específica marcado con una etiqueta;

b) transfectar adicionalmente la célula con un vector que albergue una secuencia que codifica el segundo miembro del par de unión específica;

c) poner en contacto la célula con la sustancia candidata;

d) lisar las células, poner en contacto los lisatos celulares con un anticuerpo específico para la etiqueta de epítopo, y recuperar los inmunoprecipitados que comprenden un complejo de la SIRT1 y la LXR con un adsorbente específico de anticuerpo;

e) llevar a cabo un procedimiento de análisis de transferencia Western usando anticuerpos específicos para SIRT1 y LXR; con lo que la detección de una diferencia en la formación del complejo entre la presencia del compuesto candidato y la ausencia del candidato indica que el candidato modula la interacción de la SIRT1 con la LXR.