CÉLULAS NKT NO CONVENCIONALES PARA SU USO EN TERAPIA CONTRA EL CÁNCER.

Células NKT no convencionales para su uso en terapia contra el cáncer. La invención se refiere al campo de la terapia celular. Más precisamente, la invención proporciona un subconjunto de células NKT para controlar el crecimiento tumoral. Antecedentes de la invención El factor de crecimiento transformante beta (TGFß) es una citocina polipeptídica secretada que pertenece a una amplia familia que incluye TGFß, BMP y activinas. Las tres formas de TGFß, concretamente TGFß1, TGFß2, y TGFß3, secretadas a diferentes niveles por la mayoría de los tipos de células, sirven como reguladores positivos y negativos de programas proliferativos y de diferenciación (Letterio y Roberts, 1998, Gorelik y Flavell 2000). Los animales con deficiencia o bien de TGFß2 o bien de TGFß3 mueren durante la embriogénesis, mientras que la privación de TGFß1 se asocia con miocardiopatía y trastornos del sistema inmunitario que conducen a la muerte de los animales antes de las tres semanas de edad. La señalización de TGFß implica la participación de un receptor ampliamente expresado compuesto por dos subunidades, TßRI y TßRII. Tras unirse a su receptor, TGFß induce la actividad cinasa del dominio intracelular de la subunidad TßRII común, que a su vez fosforila el dominio de cinasa de la subunidad TRI. Tras otra sesión de fosforilación catalítica, esta última facilita la regulación dependiente de Smad de la transcripción génica y activa varias otras rutas de señalización de una manera independiente de Smad (MAPK, Wnt/beta-catenina, PI3K, etc) (Derynck y Zhang, 2003). Una vez fosforiladas por el receptor TRI, las proteínas Smad asociadas al receptor (R-Smad), Smad2 y Smad3, interaccionan con Smad común (Co-Smad) Smad4. El complejo Smad2/3/4 se acumula entonces en el interior del núcleo, se une al ADN y activa la transcripción de genes diana (Massagué 2005). Recientemente, se ha descrito el factor intermedio transcripcional 1 gamma (TIF1) como un componente de unión selectivo de Smad2/3 fosforilado, garantizando una ruta de señalización independiente de Smad4 (He et al. 2006). TGFß es un factor clave en la transformación tumoral. De hecho, la respuesta de señalización de TGFß se ve afectada en la gran mayoría de los de los tumores como resultado de mutaciones que afectan a los receptores de TGFß, transductores de señal Smad, o por una pérdida selectiva de respuestas de genes citostáticos, diferenciativos o apoptóticos aguas abajo (Levy L, et al. 2006). En modelos animales, la alteración de la señalización de TGFß a menudo da como resultado neoplasia (Chang H, et al 2002). Durante la progresión tumoral, TGFß se considera un arma de doble filo. En los estadios iniciales de la tumorigénesis, actúa directamente sobre células cancerosas para suprimir la excrecencia tumoral. A medida que progresa el tumor, TGFß estimula la progresión tumoral mediante su actividad tanto en células cancerosas en sí mismas (por ejemplo en la transición epitelial a mesenquimal o EMT) como en células estromales no malignas, tales como en angiogénesis o modificación de la matriz extracelular permitiendo la invasión y metástasis. Otro efecto pro-oncogénico de TGFß, ampliamente examinado en numerosos estudios oncológicos, es su capacidad para suprimir el sistema inmunitario y de este modo permitir a las células tumorales escapar a la inmunidad de linfocitos T anticancerígenos. El TGFß provoca un empeoramiento directo de la proliferación y activación de células T, reprimiendo sus funciones y su capacidad para eliminar células potencialmente peligrosas (Letterio y Roberts 1998, Gorelik y Flavell 2000). Cuando se exponen a tumores que producen TGFß, ratones cuyas células T se han vuelto resistentes a TGFß mediante la expresión de un transgén de receptor de TGFß negativo dominante pueden preparar una respuesta inmunitaria, eliminar el tumor, y sobrevivir. Además, experimentos de transferencia adoptiva han demostrado que los linfocitos T citotóxicos (CTL) son responsables centralmente del proceso de aclaramiento del tumor. Los CTL activados utilizan normalmente dos rutas principales dependientes del contacto para destruir objetivos. Una es la ruta de exocitosis de gránulos. Cuando un CTL activado reconoce una célula tumoral, la proteína de formación de poros de membrana, perforina, media el suministro de proteasas inductoras de apoptosis granzima A o B en el interior de la célula diana. El segundo mecanismo dependiente del contacto, las rutas de ligando Fas-FasL (FasL), activa la muerte de células diana mediante la liberación de citocromo c y la activación de caspasas. Adicionalmente, se secretan mediadores solubles incluyendo TNF- e interferón (IFN) e inducen la citotoxicidad de la célula diana. Recientemente se demostró que la deleción exclusiva y específica de TßRII en células T, o la neutralización TGFß, in vivo dan como resultado la adquisición de un programa de actividad citotóxica en células T mediante la sobreexpresión de FasL, granzima A y B, perforina, TNF- e IFN (Thomas et al 2005, Marie et al 2006). Más precisamente, la ausencia de señalización de TGFß en células T induce la generación de un subconjunto de células T que también expresan marcadores de linfocitos citolíticos naturales (NK) (KIR, KAR, Karap, NKG2D...). A diferencia de los linfocitos T citolíticos naturales (NKT) convencionales, que reconoces complejos lipídicos de CD1d, este subconjunto de células reconoce, como las células T, complejos peptídicos de MHC (Marie et al 2006). Sumario de la invención ES 2 367 726 T3 2 Los inventores han mostrado ahora que este subconjunto de células NKT, denominadas NKT no convencionales (nc-NKT), tiene una capacidad única para controlar el crecimiento tumoral. En este documento se describen células NKT independientes de CD1d, para su uso en un método para el tratamiento de tumores en pacientes. Un objeto de la invención es, por tanto, el uso de células NKT independientes de CD1d, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de un tumor en un paciente. Dichas células NKT independientes de CD1d pueden obtenerse (a) cultivando una población de células T en condiciones que suprimen la ruta de señalización de TGFß, y (b) seleccionando las células que presentan al menos un marcador de NK. La composición farmacéutica controla ventajosamente el crecimiento tumoral. Leyendas de las figuras La figura 1 muestra el análisis de tejido pancreático. Ratones PDX-CRE + Kras +/- P16 -/- de 3 semanas, que desarrollan tumores pancreáticos masivos cuando tienen 2 semanas de edad, recibieron una única inyección i.p. de 2x10 5 células nc NKT (tratados con células nc NKT) o de medio (no tratados). Tres semanas después se realizó un análisis histológico. Se usaron cinco animales por grupo. Se muestran animales sanos como comparación. La observación muestra que, tras la inyección, la estructura de los canales pancreáticos vuelve sustancialmente a la normalidad. La figura 2 es un gráfico que representa el % de supervivencia de células PKP16 tras el cultivo con diferentes concentraciones de células nc NKT o de linfocitos T. Descripción detallada de la invención Definiciones Las células NKT independientes de CD1d consisten en un subconjunto de células T que expresan un receptor de células T (TCR), marcadores NK, no reconocen complejos lipídicos de CD1d pero reconocen complejos peptídicos de MHC. En ratones normales, esta población representa menos del 2% de las células T totales del bazo y alcanza el 20% cuando se les priva de señalización de TGFß. Este subconjunto de células T, descrito en Marie et al 2006, puede generarse a partir de células T vírgenes tras su activación y bloqueo de la ruta de señalización de TGF-ß. Las células nc NKT, además de los marcadores NK, expresan grandes cantidades de FasL, perforina, granzimas, IFN- y TNF-, y son altamente citotóxicas. El paciente que va a tratarse puede ser cualquier mamífero (incluyendo seres humanos, primates, caballos, reses, roedores, ganado ovino, felinos, caninos, etc), de cualquier edad o sexo. Preferiblemente el paciente es un ser humano, que puede ser un hombre o una mujer, un adulto, o un niño. En el contexto de la invención, el término tratar o tratamiento significa invertir, atenuar o inhibir el progreso o la invasividad del tumor. Producción de las células nc NKT ES 2 367 726 T3 En una realización preferida, las células nc NKT pueden obtenerse mediante diferenciación a partir de linfocitos T. Son preferiblemente de origen humano, preferiblemente del paciente o de donantes sanos. Pueden prepararse a partir de cualquier muestra biológica, tal como sangre, médula ósea o sangre del cordón umbilical. Las muestras biológicas pueden ser normales o patológicas. Por ejemplo, pueden aislarse células mononucleares de sangre periférica humanas... [Seguir leyendo]

1. Uso de células NKT independientes de CD1d, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de un tumor en un paciente. 2. Uso según la reivindicación 1, en el que dichas células NKT independientes de CD1d expresan FasL, perforina, granzimas e IFN-. 3. Uso según la reivindicación 1 ó 2, en el que dichas células NKT independientes de CD1d se obtienen a. cultivando una población de células T en condiciones que suprimen la ruta de señalización de TGFß, y b. seleccionando las células que presentan al menos un marcador NK. 4. Uso según la reivindicación 3, en el que la población de células T en (a) se cultiva en presencia de un anticuerpo anti-TGFß. 5. Uso según la reivindicación 3, en el que la población de células T en (a) se cultiva en presencia de un inhibidor de TGFß. 6. Uso según la reivindicación 3, en el que el marcador NK se selecciona del grupo que consiste en NKG2A, NKG2C, NKG2E, NKG2D, CD94, y DX5. 7. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dichas células NKT independientes de CD1d son autólogas con respecto al paciente. 8. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que la composición farmacéutica es adecuada para su inyección intravenosa o intraperitoneal. 9. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el tumor es un cáncer sólido. 10. Uso según la reivindicación 9, en el que el tumor se selecciona del grupo que consiste en cáncer de pulmón, riñón, vejiga, hígado, páncreas, colon, piel, cerebro, ovarios, cuello uterino y de mama. 11. Uso según la reivindicación 1, en el que el tumor es una hemopatía maligna, y dichas células NKT independientes de CD1d son alogénicas con respecto al paciente. 12. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que la composición farmacéutica limita o invierte el crecimiento tumoral. 7 ES 2 367 726 T3 8 ES 2 367 726 T3 9