Proteína ARN polimerasa aislada dependiente de ARN, en la que la proteína presenta,

en forma aislada sin ayuda de ninguna otra proteína, la capacidad inespecífica e independiente de cebador de sintetizar in vitro ARN cuando se pone en contacto con sustratos de ácido nucleico bajo condiciones suficientes, dicha proteína originaria de un virus de la familia de Cystoviridae y siendo dicha polimerasa capaz de catalizar la síntesis de ARN en presencia de sustratos de ARN de cadena simple, ARN de doble cadena, ADN de cadena simple y ADN de doble cadena

SECTOR DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a una proteína polimerasa nueva capaz de sintetizar ARN en presencia de diferentes plantillas de ARN y ADN. La presente invención también se refiere a un método y un kit para la síntesis de ARN mediante el contacto de dicha proteína polimerasa con diferentes plantillas de ARN y ADN bajo las condiciones apropiadas. La presente invención también se refiere a métodos para estabilizar y secuenciar ácidos nucleicos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los virus con ARN de doble cadena son conocidos por infectar diferentes huéspedes desde procariotas a eucariotas superiores. Algunos de estos virus provocan enfermedades infecciosas graves que afectan a los seres humanos y a animales y plantas importantes económicamente (Fields y Knipe, 1990). A pesar de las notables variaciones en la organización estructural y la especificidad del huésped, prácticamente todos los virus de ARN de doble cadena comparten una estrategia de replicación común. Después de la entrada, el virión se convierte en la mayoría de los casos en una partícula central que actúa como transcriptasa produciendo ARN de cadena simple en sentido positivo utilizando los ARN de doble cadena genómicos como plantillas. Los ARN de cadena simple formados en el núcleo viral se expulsan al citoplasma donde actúan como los mensajeros que dirigen la síntesis de proteínas. Los mismos ARN de cadena simple también son completamente activos como plantillas para la síntesis de cadenas “menos” complementarias (replicación). Este proceso tiene lugar en el interior de partículas del núcleo recién ensambladas y está dirigido por la polimerasa viral. Después de la replicación, la réplica del ARN de cadena “menos” permanece asociada con la plantilla de cadena “más” reconstituyendo el ARN de doble cadena genómico. Las partículas del núcleo que transportan el ARN de doble cadena pueden soportar rondas adicionales de transcripción o, de forma alternativa, someterse a una maduración posterior para formar partículas de la progenie infecciosa. Tanto la replicación como la transcripción de los virus de ARN de doble cadena dependen, de este modo, de las actividades de polimerasa codificadas por el virus y tienen lugar en el interior de un complejo proteico grande. Entre las diversas proteínas que conforman el complejo de polimerasa de cualquiera de los virus de ARN de doble cadena, sólo se ha predicho teóricamente que una especie de polipéptido contiene varios motivos conservados de la secuencia característica a lo largo de las ARN polimerasas (Koonin y otros, 1989; Bruenn, 1991; Bruenn 1993). Sin embargo, hasta ahora

experimentales para arrojar luz sobre los principios moleculares que gobiernan el metabolismo de ARN en los complejos de polimerasa de virus de ARN de doble cadena. El primero de estos sistemas era una transcripción in vitro basada en virus intactos purificados o partículas de núcleo derivadas de preparaciones de virus y, de este modo, ya contienen plantillas de ARN de doble cadena. Dichos sistemas se han descrito para reovirus (Joklik, 1974), bacteriófago

φ6 (Van Etten y otros, 1973; Partridge y otros, 1979), virus de necrosis pancreática infecciosa (Cohen, 1975), partículas del tipo del virus de la levadura (Herring y Bevan, 1977) y muchos otros. Estas estrategias han proporcionado una información detallada sobre los mecanismos y la regulación de la síntesis de ARN de cadena simple. Sin embargo, la transcripción basada en partículas no permitía dirigir cuestiones sobre la replicación.

Esto se enfocó utilizando intermedios aislados de virus que contenían ARN de cadena simple empaquetados (véase, por ejemplo, Fujimura y otros, 1986) y partículas vacías de polimerasa.

En el caso del fago φ6, se encontró que las partículas vacías del complejo de polimerasas (PC) recombinantes eran activas en el empaquetado, replicación y transcripción in vitro de ARN (Gottlieb y otros, 1990; Olkkonen y otros, 1990; Van Dijk y otros, 1995). Se demostró que otros dos sistemas, las partículas del tipo del virus de la levadura (VLPs) y las partículas de núcleo abierto de rotavirus ayudaban en la replicación de plantillas de ARN de cadena simple exógeno específico del virus (Fujimura y Wickner, 1988; Chen y otros, 1994).

El bacteriófago φ6 es un virus de ARN de doble cadena complejo de Pseudomonas syringae (Vidaver y otros, 1973). El genoma de φ6 comprende tres segmentos de ARN de doble cadena: grande (L), medio (M) y pequeño (S) (Semancik y otros, 1973; Van Etten y otros, 1974). Para los objetivos de la presente invención, se hará referencia a las cadenas en sentido positivo de los segmentos de ARN de φ6 como 1+, m+, s+; y las cadenas en sentido negativo se designarán, correspondientemente, como 1-, m-, s-. El complejo de

polimerasas completo del fago φ6 está compuesto de cuatro tipos de proteínas P1, P2, P4 y P7, todos codificados en el segmento L (Mindich y otros, 1988). P1 es la proteína estructural principal ensamblada a una cubierta dodecaédrica, estando el resto de las subunidades de proteína localizadas en las posiciones de simetría del pliegue en 5 (Butcher y otros, 1997; de Haas y otros, 1999). Los estudios sobre proteínas recombinantes individuales y partículas de PC incompletas modificadas genéticamente han permitido entender las funciones de P4 y P5. P4 es una NTPasa hexamérica responsable del empaquetamiento de ARN de cadena positiva (Gottlieb y otros, 1992a; Paatero y otros, 1995; Frilander y Bamford, 1995; Juuti y otros, 1998; Paatero y otros, 1998), mientras que P7 actúa como cofactor de proteína necesario para la reacción de empaquetamiento eficaz (Juuti y Bamford, 1995, 1997). P2, hasta ahora la proteína PC menos estudiada, se ha identificado como una supuesta subunidad de polimerasa utilizando el análisis informático de la secuencia de la proteína (Koonin y otros, 1989; Bruenn, 1991). Esta conclusión estaba respaldada además por los estudios bioquímicos sobre diferentes partículas de PC deficientes en proteína (Gottlieb y otros, 1990; Casini y otros, 1994; Juuti y Bamford, 1995).

Puede la supuesta polimerasa de un virus de ARN de doble cadena catalizar sola la síntesis de ARN dependiente de plantilla o la actividad de síntesis está estrictamente asociada con la proteína polimerasa unida a la partícula? Hasta hace poco, esta cuestión permanecía sin respuesta. Hasta ahora, ni la proteína

P2 del fago φ6 ni las supuestas polimerasas análogas de otros virus con ARN de doble cadena (excepto la polimerasa de rotavius) se han obtenido de forma aislada. Esto puede ser debido al hecho de que la supuesta polimerasa representa sólo un componente menor del complejo de polimerasas, disuadiendo de este modo cualquier intento de purificar la proteína directamente a partir de este complejo. Además, no se conoce ningún sistema de expresión génica que permita la producción de proteína polimerasa individual soluble. Para dos supuestas polimerasas, la del virus de la lengua azul y la del virus de la enfermedad bursal infecciosa, se ha descrito que cierta actividad polimerasa está asociada con los extractos crudos de las células que producen las proteínas recombinantes correspondientes (Urakawa y otros, 1989; Macreadie y Azad, 1993). Sin embargo, estos documentos no han dado a conocer ninguna prueba de la asociación directa de las actividades polimerasa observadas con las proteínas de interés. Por otro lado, se ha observado que la supuesta polimerasa de rotavirus VP1 posee ciertas actividades parciales relevantes. Se encontró que la enzima se unía a un análogo de nucleótido (Valenzuela y otros, 1991) y el ARN de cadena simple viral (Patton, 1996). Sin embargo, la proteína aislada, no conseguía replicar sustratos de ARN a menos que estuviera complementada, como mínimo, con una proteína adicional VP2 (proteína estructural principal) (Zeng y otros, 1996; Patton y otros, 1997).

En la presente invención, se muestra una polimerasa que es capaz de sintetizar ARN in vitro sin ayuda de ninguna otra proteína. Tal como será evidente a partir de la siguiente descripción, la polimerasa de la presente invención es relativamente inespecífica a la plantilla que se utiliza para la polimerización del ARN. En cambio, la especificidad de plantilla de las polimerasas dependientes de ARN de la técnica anterior era, en general, bastante estricta. Por ejemplo, la ARN polimerasa del bacteriófago...

1. Proteína ARN polimerasa aislada dependiente de ARN, en la que la proteína presenta, en forma aislada sin ayuda de ninguna otra proteína, la capacidad inespecífica e independiente de cebador de sintetizar in vitro ARN cuando se pone en contacto con sustratos de ácido nucleico bajo condiciones suficientes, dicha proteína originaria de un virus de la familia de Cystoviridae y siendo dicha polimerasa capaz de catalizar la síntesis de ARN en presencia de sustratos de ARN de cadena simple, ARN de doble cadena, ADN de cadena simple y ADN de doble cadena.

2. Proteína, según la reivindicación 1, en la que la proteína se origina de bacteriófagos relacionados con φ6.

3. Proteína, según la reivindicación 1 ó 2, en la que la proteína se origina de φ6, φ7, φ8, φ9, φ10, φ11, φ12, φ13 o φ14.

4. Proteína, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la proteína es P2 o una forma alterada o modificada genéticamente de P2, que presenta en forma aislada sin ayuda de ninguna otra proteína la capacidad inespecífica e independiente de cebador de sintetizar in vitro ARN.

5. Proteína, según cualquiera de las reivindicaciones 1

a 4, seleccionada del grupo que comprende: a) una proteína codificada por una secuencia de ácido nucleico que tiene la secuencia de ácido nucleico de SEC ID NO: 1; b) una proteína codificada por una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 8; y c) una secuencia de aminoácidos que muestra, como mínimo, el 80% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 8.

6. Proteína, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la proteína comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 8.

7. Método para la producción de la proteína, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende las etapas de:

(a) cultivar células huésped que contienen una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en un medio de cultivo para expresar dicha proteína en forma soluble;

(b) recuperar la proteína del huésped o del medio de cultivo;

(c) purificar y aislar la proteína de otras proteínas; y opcionalmente

(d) analizar la actividad de síntesis por el ARN de dicha proteína.

8. Método para el aislamiento y purificación de la proteína, según la reivindicación 7, en el que el método comprende las etapas adicionales de:

a) romper las células huésped en un tampón para obtener un lisado celular; b) aclarar dicho lisado mediante centrifugación: c) purificar la proteína utilizando, como mínimo, una etapa, más preferentemente dos etapas de cromatografía de afinidad; d) purificar adicionalmente la proteína utilizando, como mínimo, una etapa de cromatografía de intercambio iónico para obtener una fracción que está esencialmente libre de actividades nucleasa y proteasa.

9. Método para la producción in vitro de ARN, que

comprende las etapas de: -proporcionar un sustrato de ARN de cadena simple o ARN de doble cadena; -poner en contacto dicho sustrato de ARN de cadena simple o ARN de doble cadena con la proteína, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en forma aislada bajo condiciones suficientes para la síntesis de ARN; y -recuperar de la mezcla de reacción la muestra de ARN recién producida.

10. Método, según la reivindicación 9, en el que dicha muestra de ARN recién producida es ARN de doble cadena.

11. Método, según la reivindicación 9 ó 10, que comprende las siguientes etapas para la amplificación in vitro de ARN:

(a) proporcionar dicho sustrato de ARN;

(b) poner en contacto dicho sustrato de ARN con la proteína, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en forma aislada bajo condiciones suficientes tanto para la replicación de ARN como para la transcripción de ARN; y

(c) recuperar de la mezcla de reacción una mezcla de ARN amplificado recién producido.

12. Método, según la reivindicación 11, que comprende

las etapas de:

(a) proporcionar un sustrato de ARN de cadena simple;

(b) replicar dicho sustrato de ARN de cadena simple con la proteína, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en forma aislada para formar ARN de doble cadena;

(c) transcribir dicho ARN de doble cadena con la proteína, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para obtener ARN de cadena simple; y

(d) repetir las etapas de amplificación hasta haber obtenido una cantidad suficiente de productos de síntesis de ARN.

13. Método, según la reivindicación 9 ó 10, que comprende las etapas de:

(a) proporcionar un sustrato de ARN de cadena simple mediante la transcripción de una plantilla de ADN con una ARN polimerasa dependiente de ADN; y

(b) replicar dicho sustrato de ARN de cadena simple con la proteína, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en forma aislada para formar ARN de doble cadena.

14. Método, según la reivindicación 13, que comprende además las siguientes etapas para la amplificación in vitro de ARN:

(c) transcribir dicho ARN de doble cadena con la proteína, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en forma aislada para obtener ARN de cadena simple; y

(d) repetir las etapas de amplificación hasta haber obtenido una cantidad suficiente de productos de síntesis de ARN.

15. Método, según la reivindicación 13 ó 14, en el que dicha ARN polimerasa dependiente de ADN deriva de un bacteriófago, preferentemente seleccionado del grupo que comprende los bacteriófagos T7, T3, y SP6.

16. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en el que las etapas (a) y (b) se llevan a cabo de manera simultánea o secuencial en el mismo recipiente de reacción.

17. Método para la estabilización de ácidos nucleicos, que comprende las etapas de:

(a) proporcionar un sustrato de ácido nucleico de cadena simple;

(b) poner en contacto dicho sustrato de ácido nucleico de cadena simple con la proteína, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en forma aislada bajo condiciones

suficientes para la síntesis de ARN a efectos de convertir, como mínimo, parte del sustrato de ácido nucleico de cadena simple en la forma de ácido nucleico de doble cadena;

(c) recuperar los ácidos nucleicos totales de la mezcla de reacción; y

(d) poner en contacto dichos ácidos nucleicos totales con una preparación que contiene una nucleasa o nucleasas que degradan de manera selectiva los ácidos nucleicos de cadena simple, pero no los ácidos nucleicos de doble cadena; y

(e) recuperar los ácidos nucleicos de doble cadena que muestran una mayor estabilidad a la degradación por nucleasas.

18. Método para la producción in vitro de ARN, que comprende las etapas de.

(a) proporcionar un sustrato de ADN de cadena simple o ADN de doble cadena;

(b) poner en contacto dicho sustrato de ADN de cadena simple

o ADN de doble cadena con la proteína, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en forma aislada bajo condiciones suficientes para la síntesis de ARN; y

(c) recuperar de la mezcla de reacción las muestras de ácido nucleico recién producido.

19. Método, según la reivindicación 18, en el que la muestra de ácido nucleico recién producido comprende dobles cadenas que comprenden réplicas de plantillas de ADN y ARN.

20. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 19, en el que el sustrato de ácido nucleico de cadena simple o de doble cadena es lineal.

21. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 20, en el que la mezcla para la síntesis de ARN contiene, como mínimo, un nucleósido trifosfato marcado con un isótopo radioactivo

o está modificado químicamente.

22. Método para la producción in vitro de ARN, que

comprende las etapas de: -proporcionar un sustrato de ARN o ADN; -poner en contacto dicho sustrato de ARN o ADN con la proteína, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en forma aislada bajo condiciones suficientes para la síntesis de ARN en una mezcla que comprende: un sustrato de ácido nucleico, proteína, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, nucleósido trifosfatos y opcionalmente tampón, acetato de amonio, DTT, PEG, iones Mg2+, iones Mn2+ y/o BSA; y -incubar la mezcla de reacción a una temperatura suficiente para la síntesis de ARN; -recuperar de la mezcla de reacción la muestra de ácido nucleico recién producido.

23. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 22, en el que la síntesis de ARN se inicia desde el extremo 3' de un cebador complementario al sustrato de ácido nucleico.

24. Método, según la reivindicación 23, en el que dicho cebador es ARN o ADN de cadena simple.

25. Kit para la producción in vitro de ARN, que comprende:

(a) una proteína polimerasa, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en forma aislada; y opcionalmente

(b) aditivos necesarios para un nivel detectable de síntesis de ARN.

26. Kit, según la reivindicación 25, que comprende nucleósido trifosfatos en concentraciones suficientes para la síntesis de ARN.

27. Kit, según la reivindicación 25 ó 26, en el que, como mínimo, un nucleósido trifosfato está marcado con un isótopo radioactivo o está químicamente modificado.

28. Kit, según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 27, en el que el kit contiene adicionalmente una preparación (o preparaciones) estándar de ácido nucleico con capacidad caracterizada por actuar como plantilla (plantillas) para la síntesis de ARN.

29. Kit, según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 28, utilizado específicamente para la secuenciación de una molécula de ácido nucleico y que comprende, opcionalmente, como mínimo, un agente terminador de la síntesis de ARN que termina la síntesis de ARN en una base nucleotídica específica.

30. Kit, según la reivindicación 29, en el que dicho agente de terminación de la síntesis de ARN es un 3'-desoxinucleósido trifosfato o un derivado funcional del mismo.

31. Método para la determinación de la secuencia de bases nucleotídicas de una molécula de ácido nucleico lineal, que comprende las etapas de:

(a) proporcionar una molécula de ácido nucleico lineal;

(b) incubar dicha molécula de ácido nucleico bajo condiciones

- cuatro nucleósido trifosfatos o análogos funcionales de los mismos; y -como mínimo, uno de los cuatro agentes terminadores de la síntesis de ARN que terminan la síntesis de ARN en una base nucleotídica específica, en el que dicho agente termina la síntesis de ARN en una base nucleotídica diferente; y

(c) separar los productos de ARN terminados de la reacción de incubación según su tamaño, mediante lo cual, se puede determinar, como mínimo, una parte de la secuencia de bases nucleotídicas de dicha molécula de ácido nucleico.

32. Método, según la reivindicación 31, en el que dicha molécula de ácido nucleico es ARN o ADN de cadena simple.

33. Método, según la reivindicación 31, en el que dicha molécula de ácido nucleico es ARN o ADN de doble cadena.

34. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 31 a 33, que comprende la utilización, como mínimo, de uno de dichos nucleósido trifosfatos o análogos funcionales de los mismos modificados para contener un marcador detectable.

35. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 31 a 34, que comprende la utilización, como mínimo, de uno de dichos agentes terminadores de la síntesis de ARN modificado para contener un marcador detectable.

36. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 31 a 35, en el que dichos agentes terminadores de la síntesis de ARN son 3'-desoxinucleósido trifosfatos o derivados funcionales de los mismos.