Un anticuerpo humano que tiene especificidad para el componente C5 activado del sistema de complemento caracterizado porque reconoce un polipéptido que tiene al menos 80% de homología con el péptido que comprende la región correspondiente a la secuencia 731-740 del componente C5 de complemento humano,

teniendo dicho péptido la secuencia KDMQLGR↓LHMKTLLPVSK (SEC ID Nº 15) y en el que dicho anticuerpo inhibe la conversión de la cadena de alfa de C5 a C5a y C5b y en el que anticuerpo se produce de forma recombinante y comprendiendo el anticuerpo ambas secuencias de aminoácidos identificadas como SEC ID Nº 2 y SEC ID Nº 4 o sus mutaciones conservativas o teniendo el anticuerpo al menos 95% de homología con la secuencia de aminoácidos correspondiente a la secuencia SEC ID Nº 6

Campo de la invención y antecedentes de la técnica

La activación del sistema de complemento (sistema C) representa un mecanismo importante en la defensa inmune. Al mismo tiempo representa un arma de doble filo debido a que por un lado garantiza la protección del huésped pero por el otro es capaz de dañar tejidos cuando se activa el complemento por varias circunstancias patológicas. La susceptibilidad aumentada a infecciones bacterianas y trastornos autoinmunes observada en los pacientes con deficiencias heredadas del sistema C claramente demuestra la importancia particular de este sistema en la protección del huésped frente a agentes infecciosos y en la eliminación de inmunocomplejos. Estas funciones protectoras resultan de la activación del complemento en tipo cascada que genera productos biológicamente activos. Algunos de ellos, tales como C1q, C3b y C3bi, opsonizan los agentes infecciosos permitiendo su evacuación. En su lugar otros, tales como C5a y C5b67, tienen la función de reclutar células fagocíticas en el sitio de inflamación o lisar dianas sensibles como en el caso del complejo de ataque a membrana (MAC). Desafortunadamente estas moléculas, una vez que se producen, no son capaces de diferenciar entre dianas endógenas y exógenas y provocarían daño grave a tejidos y células si estos no estuvieran protegidos por potentes inhibidores de membrana o extracelulares que actúan a diversos niveles en la cascada de activación del complemento. Sin embrago, la acción de los inhibidores se ve sobrepasada en presencia de una activación masiva del sistema C, en enfermedades infecciosas graves o trastornos auto inmunes y el complemento activado provoca destrucción tisular y celular.

El fragmento C5a y el complejo terminal C (TCC) están entre los productos implicados en la destrucción tisular en varios procesos inflamatorios. Pueden encontrarse estos productos de activación a niveles por encima de lo normal en fluido sinovial de pacientes con artritis reumatoide y en fluido cerebroespinal de pacientes con varias enfermedades del sistema nervioso central. También se han hallado niveles elevados de C5a en pacientes con politraumatismos así como en pacientes con lesiones de isquemia miocárdica y reperfusión.

Por tanto ahora se reconoce el papel de C5a en el desarrollo de estas enfermedades. Esto se demuestra por las señales de estrés pulmonar, hipotensión y leucopenia mostradas por animales que han recibido inyección intravenosa de esta anafilatoxina. Además la instilación bronquial de C5a es capaz de inducir reacciones inflamatorias fuertes en pulmón de conejo.

TCC se genera a partir del fragmento C5b liberado por escisión enzimática de C5 por la acción de C5 convertasa. Recientemente se ha demostrado que TCC induce inflamación debido al daño tisular derivado de su actividad lítica y de numerosos efectos no citotóxicos sobre fagocitos y otros tipos celulares.

TCC se ha identificado en varios tejidos en diversas afecciones patológicas, incluyendo artritis reumatoide, glomerulopatía, esclerosis múltiple, neuropatías periféricas desmielinizantes, aterosclerosis e infarto de miocardio. El desarrollo de modelos animales experimentales de estas enfermedades con deficiencias selectivas en componentes C tardíos ha contribuido adicionalmente a definir el papel de estos componentes en el desarrollo de daño tisular.

Debido al papel fundamental desempeñado por C5a y TCC en promover la inflamación crónica y el daño tisular, se han realizado varios intentos para neutralizar los componentes tardíos del complejo C como estrategia terapéutica para prevenir estas complicaciones en enfermedades asociadas con activación de C5. Esta molécula resulta ser un diana terapéutica ideal, puesto que su neutralización inhibe la secuencia tardía de acontecimientos de activación de la cascada, sin interferir con la actividad opsonizadora de los componentes tempranos de esta cascada. Anticuerpos monoclonales de ratón específicos para C5 humano, de ratón y de rata y capaces de inhibir la producción de C5a y del complejo de ataque a membrana (MAC) ya están disponibles en el mercado. Los anticuerpos anti-C5 se han usado de forma exitosa en ratones para evitar el desarrollo de artritis inducida por colágeno y para mejorar el ciclo clínico de glomerulonefritis, y en ratas para reducir isquemia miocárdica y reperfusión.

En los últimos años se han producido dos anticuerpos de cadena sencilla (anticuerpo de cadena sencilla o fragmento variable de cadena sencilla, scFv) ambos de los cuales se describen en la Solicitud de Patente WO 95/29697. Estos anticuerpos son capaces de penetrar tejidos más rápidamente que el anticuerpo completo. El primer anticuerpo de cadena sencilla obtenido por ensamblaje de regiones variables de un anticuerpo de ratón para C5 conserva la capacidad del anticuerpo original de inhibir el ensamblaje del MAC y bloquear parcialmente la producción de C5a (Evans, M. J y col, 1995, Mol. Immunol. 32:1183). Además, este anticuerpo es capaz de prevenir los depósitos de C5b-9 en el corazón con reperfusión de plasma humano o en insuficiencia cardiaca. El segundo scFv es un anticuerpo de ratón humanizado anti-C5 que se obtiene por inserción de regiones CDR murinas (regiones determinantes de complementariedad) en la estructura de la región variable de las cadenas ligera y pesada humanas. Este anticuerpo (Thomas, T. C. y col., 1996, Mol. Immunol. 33:1389) es capaz de inhibir la formación de C5a y C5b-9 aunque el epítopo reconocido mapeado alrededor de los aminoácidos 860-865 de la molécula C5 y correspondiente al péptido KSSKC, resulta estar lejos del sitio de escisión de C5 convertasa. Además estudios posteriores (Fitch, J. C. y col., 1999, Circulation 100:2499) han demostrado que este anticuerpo es capaz de inhibir la actividad hemolítica del complemento, atenuar el daño miocárdico, daño cognitivo y hemorragia postoperatoria en un grupo de pacientes con derivación cardiopulmonar.

**(Ver fórmula)**

El documento WO02/30985 A desvela inhibidores de C5, que inhiben activación de células endoteliales de tipo II, en los que la inhibición se manifiesta por la supresión de E-selectina. Estos inhibidores son útiles en el tratamiento de rechazo de xenotransplantes retardado o rechazo vascular agudo. Los inhibidores incluyen moléculas de anticuerpo, así como homólogos, análogos y formas modificadas o derivadas de los mismos, incluyendo fragmentos de inmunoglobulina tales como Fab, F(ab')2 y Fv, moléculas pequeñas, incluyendo péptidos, oligonucleótidos, peptidomiméticos y compuestos orgánicos. Se generaron ejemplos de anticuerpos monoclonales que se unen e inhiben C5, y se designan MAb 137-76 y MAb 137-30. El documento no especifica el sitio de unión a anticuerpo.

Sumario

De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona el anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1. Por lo tanto, el principal aspecto de la invención se refiere a un anticuerpo de origen humano específico para el componente C5 de complemento activado y caracterizado por el hecho de que inhibe la escisión de la cadena alfa de C5 en C5a y C5b. En particular, el anticuerpo es recombinante y reconoce un epítopo que comprende el sitio proteolítico para la C5 convertasa en la cadena alfa del componente de complemento C5.

De acuerdo con una realización preferida, el anticuerpo recombinante se compone de una cadena sencilla (scFv) que comprende una región variable de la cadena ligera unida covalentemente con una región variable de la cadena pesada y, de acuerdo con un aspecto aún más preferido, se compone de o comprende ambas secuencias de aminoácidos identificadas como SEC ID Nº: 2 y SEC ID Nº: 4 o proteínas que tienen al menos 95% de homología con la secuencia de aminoácidos correspondiente a SEC ID Nº: 6 de acuerdo con la reivindicación 1.

De acuerdo con un aspecto adicional, la invención incluye las secuencias de nucleótidos aisladas que codifican anticuerpos específicos para el componente C5 de complemento activado de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 9 y en particular que comprenden SEC ID Nº: 5. Un aspecto adicional de la invención se refiere a los vectores que contienen las secuencias anteriormente mencionadas. De acuerdo con un aspecto adicional, la invención se refiere al uso terapéutico de los anticuerpos reivindicados, proteínas y secuencias de nucleótidos para la preparación de fármacos que previenen y tratan enfermedades que implican activación descontrolada del sistema de complemento, en particular artritis reumatoide, glomerulonefritis, esclerosis múltiple, neuropatías periféricas desmielinizantes,... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo humano que tiene especificidad para el componente C5 activado del sistema de complemento caracterizado porque reconoce un polipéptido que tiene al menos 80% de homología con el péptido que comprende la región correspondiente a la secuencia 731-740 del componente C5 de complemento humano, teniendo dicho péptido la secuencia KDMQLGR↓LHMKTLLPVSK (SEC ID Nº 15) y en el que dicho anticuerpo inhibe la conversión de la cadena de alfa de C5 a C5a y C5b y en el que anticuerpo se produce de forma recombinante y comprendiendo el anticuerpo ambas secuencias de aminoácidos identificadas como SEC ID Nº 2 y SEC ID Nº 4 o sus mutaciones conservativas o teniendo el anticuerpo al menos 95% de homología con la secuencia de aminoácidos correspondiente a la secuencia SEC ID Nº 6.

2. Anticuerpo recombinante de acuerdo con la reivindicación 1 en el que dicho componente C5 es de mamífero.

3. Anticuerpo recombinante de acuerdo con la reivindicación 2 en el que dicho mamífero se selecciona del grupo que consiste en: ser humano, ratón, rata, conejo.

4. Anticuerpo recombinante de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizado porque está en forma de cadena sencilla (scFv) que comprende una región variable de la cadena ligera unida covalentemente a una región variable de la cadena pesada.

5. Anticuerpo recombinante de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado por el hecho de que la cadena ligera es una cadena lambda y la región variable de la cadena pesada es la región VH3.

6. Anticuerpo recombinante de acuerdo con la reivindicación 5 caracterizado porque tiene la secuencia de aminoácidos correspondiente a SEC ID Nº 6.

7. Anticuerpo recombinante de acuerdo con la reivindicación 5 caracterizado porque comprende la secuencia SEC ID Nº 6 en combinación con una secuencia derivada de una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina.

8. Anticuerpo recombinante de acuerdo con la reivindicación 7 en el que dicha región constante de cadena pesada de inmunoglobulina se selecciona del grupo que consiste en: cadena pesada de IgA humana, cadena pesada de IgG humana, cadena gamma pesada murina, cadena pesada de Rattus norvegicus.

9. Anticuerpo recombinante de acuerdo con la reivindicación 8 caracterizado porque es dimérico.

10. Proteína quimérica recombinante caracterizada po que comprende la secuencia correspondiente a SEC ID Nº 6

o una secuencia proteica que tiene al menos 95% de homología con SEC ID Nº 6, reconociendo dicha proteína quimérica recombinante un polipéptido que tiene al menos 80% de homología con el péptido que comprende la región correspondiente a la secuencia 731-740 del componente C5 de complemento humano, teniendo dicho péptido la secuencia KDMQLGR↓LHMKTLLPVSK (SEC ID Nº 15) y en el que dicha proteína quimérica recombinante inhibe la conversión de la cadena alfa de C5 a C5a y C5b.

11. Secuencias de nucleótidos aisladas que codifican los anticuerpos recombinantes de acuerdo con las reivindicaciones 1-9.

12. Secuencia de nucleótidos de acuerdo con la reivindicación 11 caracterizada porque comprende la secuencia SEC ID Nº 5.

13. Vectores que comprenden secuencias de nucleótidos de acuerdo con las reivindicaciones 11 y 12.

14. Vectores de acuerdo con la reivindicación 13 caracterizados por el hecho de ser vectores de expresión en bacterias, levaduras o células eucariotas superiores.

15. Anticuerpos recombinantes de acuerdo con las reivindicaciones 1-9 o proteínas de acuerdo con la reivindicación 10 para uso diagnóstico o terapéutico.

16. Secuencias de nucleótidos de acuerdo con las reivindicaciones 11-12 o vectores de acuerdo con las reivindicaciones 13 y 14 para uso terapéutico o diagnóstico.

17. Uso de anticuerpos o proteínas recombinantes de acuerdo con la reivindicación 15 o secuencias de nucleótidos de acuerdo con las reivindicaciones 11-12 para la preparación de un medicamento para la prevención y el tratamiento de enfermedades inflamatorias crónicas o agudas.

18. Uso de acuerdo con la reivindicación 17 en el que la enfermedad crónica se selecciona entre: artritis reumatoide, glomerulonefritis, esclerosis múltiple, neuropatías periféricas desmielinizantes, ateroesclerosis.

19. Uso de acuerdo con la reivindicación 17 en el que la enfermedad aguda se selecciona de: disfunción de órganos múltiples e infarto de miocardio.

20. Uso de acuerdo con la reivindicación 17 para la preparación de un medicamento para daño del miocardio de

reperfusión después de isquemia.

21. Composiciones farmacéuticas que comprenden como el principio activo cualquiera de los anticuerpos recombinantes de acuerdo con las reivindicaciones 1-9 o de las proteínas de acuerdo con la reivindicación 10 o de las secuencias de nucleótidos de acuerdo con las reivindicaciones 11-12 en combinación con excipientes y/o diluyentes adecuados.

22. Procedimiento para seleccionar anticuerpos anti-C5 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-10 dotados con la capacidad de inhibir la formación de C5a a partir de C5, caracterizado porque comprende una primera etapa de selección del antígeno C5 y una segunda etapa de selección por medio de inhibición de ensayo hemolítico en glóbulos rojos de oveja (SRBC).

23. Procedimiento para la preparación de los anticuerpos o proteínas recombinantes de acuerdo con las reivindicaciones 1-10 caracterizado porque se usan secuencias de nucleótidos aisladas de acuerdo con las reivindicaciones 11-12.

24. Uso de anticuerpos recombinantes de acuerdo con las reivindicaciones 1-9 o de secuencias de nucleótidos de acuerdo con las reivindicaciones 11-12 para establecer modelos animales no humanos de enfermedades causadas por hiperactivación del sistema de complemento.

25. Kit que comprende al menos uno de los anticuerpos recombinantes de acuerdo con las reivindicaciones 1-9 o al menos una de las secuencias de nucleótidos de acuerdo con las reivindicaciones 11-12.

26. Procedimiento para la selección de inhibidores de la conversión del componente C5 de complemento activado a sus fragmentos biológicamente activos, caracterizado por el uso de anticuerpos o proteínas recombinantes de acuerdo con las reivindicaciones 1-10.

27. Uso de un péptido que tiene la secuencia KDMQLGR↓LHMKTLLPVSK para la selección de anticuerpos de acuerdo con la reivindicación 1.

28. Animales transgénicos no humanos, caracterizados por el hecho de expresar secuencias de nucleótidos de acuerdo con las reivindicaciones 11-12.

29. Células aisladas caracterizadas por transformarse con las secuencias de nucleótidos de acuerdo con las reivindicaciones 11-12 o por los vectores de acuerdo con las reivindicaciones 13-14.

30. Anticuerpo recombinante de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado por el hecho de que la cadena ligera es una cadena kappa o V3/V2-14.

31. Anticuerpo recombinante de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado por el hecho de que la cadena ligera es V4/DPK24.

32. Anticuerpo recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5, 30 y 31, caracterizado por el hecho de que la región variable de la cadena pesada es VH3/V-48.