VARIANTES HIPOALERGENICAS DEL ALERGENO PRINCIPAL DEL POLEN DE BETULA VERRUCOSA.
Proteína que es una variante hipoalergénica del alérgeno principal del polen de Betula verrucosa (Bet v 1) y que se caracteriza por:
a) mostrar una reactividad reducida frente a IgE en comparación con Bet v 1 de tipo natural (SEQ ID NO:1);
b) tener una secuencia de aminoácidos que:
i) es al menos el 87%, preferiblemente al menos el 94%, más preferiblemente al menos el 97% idéntica a SEQ ID NO:1;
ii) en una alineación de secuencia con SEQ ID NO:1, presenta una sustitución o deleción del residuo de Lys correspondiente al aminoácido 54 de SEQ ID NO:1
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2006/012237.
Solicitante: LOFARMA S.P.A..
Nacionalidad solicitante: Italia.
Dirección: VIALE CASSALA, 40,20143 MILANO.
Inventor/es: FALAGIANI, PAOLO, MISTRELLO, GIOVANNI, RONCAROLO, DANIELA, ZANOTTA, STEFANIA.
Fecha de Publicación: .
Fecha Concesión Europea: 17 de Febrero de 2010.
Clasificación Internacional de Patentes:
- A61K39/36 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE. › A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › A61K 39/00 Preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos (materiales para ensayos inmunológicos G01N 33/53). › del polen.
- C07K14/415 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › de vegetales.
Clasificación PCT:
- A61K39/36 A61K 39/00 […] › del polen.
- C07K14/415 C07K 14/00 […] › de vegetales.
- C12N15/00 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K).
Fragmento de la descripción:
Variantes hipoalergénicas del alérgeno principal del polen de Betula verrucosa.
La presente invención proporciona variantes de secuencia hipoalergénicas de la proteína Bet v 1, moléculas de ácido nucleico que las codifican, composiciones farmacéuticas que contienen las mismas y su uso en la profilaxis y el tratamiento de enfermedades alérgicas provocadas por el polen de plantas de la especie Betula verrucosa.
Antecedentes de la invención
Las alergias están provocadas por una disfunción del sistema inmunitario, que reacciona frente a proteínas inocuas contenidas en polen, ácaros, epitelios y ciertos alimentos produciendo anticuerpos de la clase IgE.
Datos recientes indican que más del 10% de la población en los países occidentales padece esta enfermedad, cuyos síntomas pueden deteriorarse con el tiempo dando lugar a, por ejemplo, asma o una sensibilización a otros alérgenos haciendo así más difícil la elección del tratamiento apropiado.
La inmunoterapia hiposensibilizante específica, a diferencia de la terapia farmacológica, es el único tratamiento etiológico de enfermedades alérgicas que puede cambiar favorablemente los parámetros inmunológicos en los que se basan estas enfermedades.
La inmunoterapia hiposensibilizante consiste en la administración de dosis crecientes de extractos normalizados (vacunas) obtenidos de la misma sustancia que provoca la enfermedad (1). De este modo, se induce gradualmente en el paciente una especie de tolerancia inmunológica a dicha sustancia con la desaparición posterior de los síntomas alérgicos.
Sin embargo, el riesgo de provocar efectos secundarios graves (2), aunque se reduce notablemente con el uso de o bien vacunas de liberación lenta o bien vacunas administradas a través de vías alternativas a las inyecciones, ha limitado de hecho la aplicación de la inmunoterapia hiposensibilizante específica en el tratamiento de enfermedades alérgicas.
En los últimos años, la mayor parte de la atención se ha centrado en el desarrollo de vacunas eficaces, más seguras. En particular, el desarrollo de vacunas que consisten en proteínas recombinantes mutagenizadas, es decir, variantes hipoalergénicas que pueden influir favorablemente en la evolución natural de la enfermedad sin provocar efectos secundarios no deseados (3), ha representado un objetivo importante.
El polen de plantas conocidas taxonómicamente como Fagales (abedul, aliso, avellano, roble, carpe) es una de las causas más importantes de asma y rinitis alérgica en las regiones templadas. Los dos alérgenos principales del polen del abedul, Bet v 1 (ADNc depositado en GenBank con el n.º de registro X15877) y Bet v 2 (n.º de registro M65179) son proteínas con un peso molecular de 17 y 14 kD, respectivamente (4, 5). Casi el 95% de los pacientes con alergia al polen del abedul producen anticuerpos IgE contra Bet v 1 y el 60% de estos pacientes muestran reactividad contra Bet v 1 solo (6).
Bet v 1 está presente de manera natural en más de diez isoformas que muestran una identidad de secuencia comprendida entre el 84,4% y el 99,4% (7). Este alérgeno pertenece a la familia de las "proteínas relacionadas con la patogénesis", es decir, proteínas ubicuas producidas por plantas en respuesta a estrés patológico o medioambiental, cuyas funciones se supone que están relacionadas con el transporte de esteroides (8,9). La alta homología de secuencia con los alérgenos del grupo 1 en el polen de otras plantas del orden Fagales explica por qué los pacientes con IgE específicas para Bet v 1 muestran síntomas alérgicos durante la temporada de polinización de diferentes plantas que pertenecen al mismo orden taxonómico (10). La alergia al polen del abedul va acompañada a menudo por reacciones adversas provocadas por la ingesta de frutas (por ejemplo, cereza, manzana, pera) u hortalizas (por ejemplo, apio y zanahoria) frescas. El motivo es que tales alimentos contienen proteínas caracterizadas por una alta homología de estructura y secuencia con Bet v 1, que son reconocidas por IgE específicas producidas por el alérgeno principal del abedul (11). La inmunoterapia con el alérgeno Bet v 1 puede ser eficaz en el tratamiento de la alergia al polen del abedul así como la polinosis a otras plantas del orden Fagales y la alergia a alimentos que contienen alérgenos que reaccionan de manera cruzada con Bet v 1 (12).
Un factor que se correlaciona con los efectos beneficiosos de la inmunoterapia hiposensibilizante es la inducción de anticuerpos IgG específicos para el alérgeno sensibilizante. Tales anticuerpos (protectores) pueden inhibir la unión de IgE al antígeno, específicamente a Bet v 1, alterando la conformación tridimensional de esta molécula (13, 14). El desarrollo de vacunas que consisten en proteínas recombinantes que poseen menos alergenicidad y propiedades inmunogénicas inalteradas mejoraría el tratamiento de enfermedades alérgicas.
Descripción de la invención
Se ha encontrado ahora que sustituyendo o delecionando uno o más residuos de aminoácido dentro de la secuencia de proteína del alérgeno Bet v 1, éste se hace menos reactivo frente a los anticuerpos IgE.
En un primer aspecto, la invención proporciona una proteína hipoalergénica que es una variante de secuencia del alérgeno Bet v 1, caracterizada por:
Se prefieren variantes de sustitución en vez de deleción, especialmente aquéllas en las que el residuo de Lys en la posición indicada se sustituye por un aminoácido neutro o polar. Más preferiblemente, dicho aminoácido neutro o polar se selecciona de Ala, Thr, Gly, Pro, Leu, Ile, Ser, Phe, aún más preferiblemente de Ala, Thr y Ser.
En una realización preferida, la proteína hipoalergénica consiste en SEQ ID NO:2.
Las variantes de sustitución y/o deleción del alérgeno Bet v 1 según esta invención, en comparación con su equivalente de tipo natural, muestran una reducción de la reactividad de IgE en al menos el 25%, preferiblemente al menos el 50%, más preferiblemente al menos el 80%, frente al suero de pacientes alérgicos al polen de Betula verru- cosa.
La reactividad de IgE de la proteína SEQ ID NO:2 de un conjunto de sueros de pacientes alérgicos se sometió a prueba en un ensayo ELISA (figura 1). En comparación con el alérgeno Bet v 1 de tipo natural (SEQ ID NO:1), se observó una reducción media del 56% de la reactividad de IgE con SEQ ID NO: 2, cuando se incubó esta proteína con diversas diluciones (desde 1:2 hasta 1:8) de conjuntos de suero de pacientes alérgicos al polen del abedul.
Estos resultados se confirmaron mediante experimentos de ELISA de inhibición, que permiten evaluar la reactividad de epítopos homólogos de diferentes proteínas. Estos resultados indican claramente que la sustitución del aminoácido en la posición 54 de SEQ ID NO:1 disminuye el reconocimiento del alérgeno Bet v 1 por IgE.
Además, la reactividad de la proteína de SEQ ID NO:2 frente a IgE de un conjunto de suero positivo para polen de Betula verrucosa se sometió a ensayo mediante inmunotransferencia de tipo Western. También en este caso, se observó una reducción de la reactividad de IgE en los sueros analizados, que, en comparación con Bet v 1 de tipo natural (SEQ ID NO:1), era del 88% para SEQ ID NO:2 (figura 3).
En un aspecto adicional, la invención proporciona un péptido inmunológicamente activo correspondiente a un fragmento de Bet v 1 que contiene desde 15 hasta 35, más preferiblemente desde 15 hasta 20 residuos de aminoácido y que porta las sustituciones y/o deleciones descritas anteriormente. Tal como se usa en el presente documento, la expresión "péptido inmunológicamente activo" indica un péptido que puede provocar una respuesta inmunitaria dependiente de IgE.
Pueden prepararse fácilmente variantes de sustitución y/o deleción según la invención mediante mutagénesis de la secuencia de ADNc de Bet v 1 (SEQ ID NO:6) usando métodos y técnicas conocidos...
Reivindicaciones:
1. Proteína que es una variante hipoalergénica del alérgeno principal del polen de Betula verrucosa (Bet v 1) y que se caracteriza por:
2. Proteína según la reivindicación 1, en la que dicho residuo de Lys se sustituye por aminoácidos neutros o polares.
3. Proteína según la reivindicación 2, en la que dichos aminoácidos neutros o polares se seleccionan de Ala, Thr, Gly, Pro, Leu, Ile, Phe, Ser.
4. Proteína según la reivindicación 3, en la que dichos aminoácidos son Ala, Ser o Thr.
5. Proteína según la reivindicación 1, que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:2.
6. Fragmento de péptido inmunológicamente activo de una proteína según las reivindicaciones 1-5, que contiene desde 15 hasta 35 aminoácidos y que porta la sustitución y/o deleción de Lys tal como se definió anteriormente.
7. Péptido según la reivindicación 6, que contiene desde 15 hasta 20 aminoácidos.
8. Molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína según las reivindicaciones 1-5 o para un péptido según las reivindicaciones 6-7.
9. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 8, que tiene la secuencia SEQ ID NO:7.
10. Vector que contiene la molécula de ácido nucleico según las reivindicaciones 8-9.
11. Célula huésped que contiene el vector según la reivindicación 10.
12. Composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de una proteína según las reivindicaciones 1-5, o un péptido según las reivindicaciones 6-7, junto con vehículos y excipientes farmacéuticamente aceptables.
13. Composición según la reivindicación 12, que está en forma de una vacuna.
14. Uso de una proteína según las reivindicaciones 1-5, o un péptido según las reivindicaciones 6-7, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento profiláctico o terapéutico de enfermedades alérgicas.
15. Uso según la reivindicación 14, para el tratamiento de asma bronquial, rinitis, conjuntivitis y dermatitis atópica.
Patentes similares o relacionadas:
Plantas con rendimiento incrementado y método de obtención de dichas plantas, del 15 de Julio de 2020, de CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (CNRS): Método para mejorar por lo menos un carácter fenotípico seleccionado de entre el rendimiento en semillas, la velocidad de germinación o el crecimiento […]
Polinucleótidos aislados y métodos y plantas que usan los mismos para regular la acidez de las plantas, del 10 de Junio de 2020, de The State of Israel, Ministry of Agriculture and Rural Development, Agricultural Research Organization, (A.R.O.), Volcani Cent: Una célula de planta o una planta que comprende una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido […]
Gen Cullin1 modificado, del 3 de Junio de 2020, de RIJK ZWAAN ZAADTEELT EN ZAADHANDEL B.V.: Gen Cullin1 modificado que comprende una modificación en la secuencia de nucleótidos de Cullin1 de tipo salvaje de SEQ ID NO: 1:, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: […]
Anticuerpos anti-ricina y sus usos, del 8 de Abril de 2020, de HER MAJESTY THE QUEEN IN RIGHT OF CANADA AS REPRESENTED BY THE MINISTER OF NATIONAL DEFENCE: Un anticuerpo, aislado o purificado, o fragmento de este, que comprende una cadena ligera variable que comprende una CDR L1 de secuencia KASQDINNYLR […]
Ensayo mejorado para el diagnóstico de alergia al cacahuete, del 1 de Abril de 2020, de EUROIMMUN MEDIZINISCHE LABORDIAGNOSTIKA AG: Un vehículo útil para el diagnóstico que comprende un medio para capturar específicamente un anticuerpo contra un epítopo del extremo C-terminal […]
Combinación de dos elementos genéticos para el control del desarrollo del tipo floral de una planta dicotiledónea, y utilización en procedimientos de detección y selección, del 1 de Abril de 2020, de Institut national de recherche pour l'agriculture, l'alimentation et l'environnement: Utilización de una combinación de dos elementos genéticos para el control del desarrollo del tipo floral de una planta dicotiledónea, comprendiendo dicha combinación, respectivamente: […]
Péptidos antiinflamatorios, y usos de los mismos, del 25 de Marzo de 2020, de Nuritas Limited: Péptido seleccionado de SEQ ID NO: 343 ó 344. Variante antiinflamatoria de un péptido según la reivindicación 1, que tiene de 1 a 3 alteraciones […]
Proteínas de armazón derivadas de cistatinas vegetales, del 18 de Marzo de 2020, de UNIVERSITY OF LEEDS: Una proteína de armazón sintética que comprende la secuencia: NSLEIEELARFAVDEHNKKENALLEFVRVVKAKEQ(Xn)TMYYLTLEAKDGGKKKLYEAKVWVK( Xn)NFKELQEFKPVGDA (SEQ ID NO: 4) o una secuencia […]