Variantes hipoalergénicas del alérgeno principal del polen de abedul.

Una proteína hipoalergénica que es una variante de secuencia del alérgeno principal de Bet v 2 y que se caracteriza por:

a) reactividad reducida ante las IgE en comparación con el alérgeno Bet v 2 silvestre (sec. con núm. de 5 ident.:1); y

b) una secuencia de aminoácidos que:

i. es al menos 90% idéntica a la sec. con núm. de ident.:1; y

ii. en una alineación de secuencia con la sec. con núm. de ident.:1, presenta al menos una sustitución de los residuos de Ser o Lys que coinciden con Ser39, Lys 45, Lys88o Lys89 en la sec. con núm. de ident.:1.

Variantes hipoalergénicas del alérgeno principal del polen de abedul.

La presente invención proporciona variantes de secuencias hipoalergénicas de la proteína Bet v 2, moléculas de ácido nucleico que las codifican, composiciones farmacéuticas que contienen las mismas y su uso en la profilaxis y terapia de enfermedades alérgicas causadas por el polen de plantas de la especie Betula verrucosa.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las alergias son causadas por una disfunción en el sistema inmune, que reacciona a las proteínas inocuas contenidas en el polen, los ácaros, epitelios y ciertos alimentos mediante la producción de anticuerpos de clase IgE.

Datos recientes indican que más del 10% de la población en los países occidentales sufre de esta enfermedad, cuyos síntomas pueden deteriorarse con el tiempo dando lugar a, por ejemplo, asma o una sensibilización a otros alérgenos haciendo así más difícil la elección de la terapia apropiada.

La inmunoterapia hiposensibilizante específica (SIT) , a diferencia de la terapia farmacológica, es el único tratamiento etiológico de enfermedades alérgicas capaz de cambiar favorablemente los parámetros inmunológicos característicos de este tipo de enfermedades.

La inmunoterapia hiposensibilizante consiste en la administración de dosis crecientes de extractos normalizados (vacunas) obtenidos a partir de la misma sustancia que causa la enfermedad (1) . De esta manera, se induce gradualmente una especie de tolerancia inmunológica a dicha sustancia en el paciente con la desaparición posterior de los síntomas alérgicos.

Sin embargo, el riesgo de provocar efectos secundarios graves (2) , aunque notablemente reducidos con el uso de las vacunas de liberación lenta o vacunas administradas a través de rutas alternativas a la inyección, de hecho ha limitado la aplicación de la inmunoterapia hiposensibilizante específica en el tratamiento de enfermedades alérgicas.

En los últimos años, la atención se ha centrado en el desarrollo de vacunas más seguras, eficaces, en particular las vacunas que consisten de proteínas recombinantes mutagenizadas, es decir, variantes hipoalergénicas capaces de influir favorablemente en la progresión natural de la enfermedad sin causar efectos secundarios no deseados (3) .

Uno de los factores beneficiosos de la SIT es la inducción si los anticuerpos IgG específicos para el alérgeno sensibilizante. Estos anticuerpos (protectores) pueden inhibir la unión antígeno-IgE, específicamente la unión de IgE al antígeno Bet v 2, alterando la configuración tridimensional de las moléculas (4, 5) . El desarrollo de vacunas que contienen proteínas recombinantes hipoalergénicas con propiedades inmunogénicas inalteradas puede mejorar el enfoque terapéutico de las enfermedades alérgicas.

El polen de las plantas taxonómicamente conocidas como Fagales (abedul, aliso, avellano, roble, carpe) es una de las causas más importantes de rinitis alérgica y asma en las regiones templadas. Los dos alérgenos principales de polen de abedul, Bet v 1 (ADNc depositada en el GenBank con núm. de acceso X15877) y Bet v 2 (núm. M65179) son proteínas con peso molecular de 17 y 14 kD, respectivamente (6, 7) . El Bet v 2 pertenece a la familia profilina, que son proteínas citoplasmáticas ubicuas implicadas en la regulación del citoesqueleto de la célula eucariota. Estas interactúan específicamente con al menos dos (macro) moléculas celulares, o sea, la fosfatidilinositol-4, 5-bifosfato, impidiendo de este modo la hidrólisis de este ácido graso por la fosfolipasa C-γ (8) , y la actina, modulando su polimerización (9) . La alta expresión de profilinas en el polen maduro y germinativo sugiere su implicación en la regulación de los precursores de microfilamentos que intervienen en el proceso de germinación (10) . Las profilinas se identificaron como alérgenos en el polen de muchas plantas arbóreas y herbáceas y en muchas frutas y verduras y por lo tanto se definieron 'pan-alérgenos', a pesar del hecho de que se encuentran en sólo 20% de los pacientes alérgicos al polen (11, 12) .

La alta homología de secuencia, superior al 60% en la mayoría de profilinas de plantas de diverso origen, causa la sensibilización cruzada no sólo con el polen de plantas botánicamente correlacionadas (13) y no correlacionadas (14) sino también entre el polen y alimentos de plantas (15) o entre el polen y el látex (16) . La homología entre las profilinas de las planta y de los mamíferos es bastante baja, sin embargo, estas mostraron ser capaces de unirse a la actina de diferentes especies y mostraron capacidad de intercambio (17, 18, 19) . Una explicación es que todas las profilinas comparten una estructura tridimensional similar, como se muestra usando cristalografía de rayos X (20, 21, 22) .

Muchos estudios confirman la equivalencia inmunológica de las profilinas. De hecho, se demostró que las IgE de pacientes sensibilizados para un profilina determinada son capaces de unirse a profilinas de origen diferente y que la unión de IgE a las profilinas puede ser mutuamente inhibida (16) .

La alta reactividad cruzada entre diferentes profilinas permite el uso de una sola profilina para el diagnóstico de alergia y el Bet v 2 recombinante se usa a menudo como el alérgeno de elección para la determinación de profilina-IgE específica (23, 24) .

Hay muchos estudios sobre la determinación de epítopos IgE profilina.

Vrtala (1996) (25) mutagenizó el Bet v 2 en las posiciones Phe44 y Gln47, que cambiaron en Tyr44, Glu47 y Asn47, de acuerdo con estudios contemporáneos llevados a cabo por el mismo grupo (26) , donde se identificó un epítopo lineal reconocido por el anticuerpo monoclonal 4A6. El epítopo reconocido por este anticuerpo se mapeó mediante el uso de dodecapéptidos sintéticos que abarcaron la secuencia de aminoácidos completa de Bet v2. Los péptidos que se unían de manera más eficiente al anticuerpo contenían las regiones entre los aminoácidos 38-49 y 40-51. La importancia del residuo Gln47 en la unión de IgG-péptido se apoyó en la evidencia que 4A6 no era capaz de reconocer las profilinas de Nicotiana tabacum y Phleum pratense, cuyas secuencias presentan un glutamato en lugar de Gln47 en Bet v 2. A diferencia de la mutación Gln47→Glu47, el cambio de Phe44 a Tyr44 o de Gln47 a Asn47 no afectó la unión del anticuerpo. Las mismas mutaciones (Gln47 a Glu o Asn y Phe44 a Tyr44) aplicadas al Bet v 2 recombinante fueron incapaces de disminuir la unión entre la profilina e IgE, como se muestra por los experimentos de inmunotransferencia y ELISA (25) .

En un estudio posterior publicado en 1997 (22) , los principales epítopos de IgE se identificaron mediante la clonación de fragmentos aleatorios de ADNc de profilina de abedul de una biblioteca de expresión probada con sueros de pacientes alérgicos a las profilinas. Tres regiones, correspondientes a las hélices alfa localizadas en los terminales amino (aa 1-30) y carboxi (aa 106-132) y a un fragmento comprendido entre los residuos 30 y 50, probaron ser más reactivas.

En un estudio posterior (23) , la búsqueda de epítopos IgE se basó en la comparación entre los modelos estructurales teóricos para profilinas de diferentes plantas y cristales de profilina de abedul o látex Se predijeron once posibles epítopos conformacionales, que consisten en las regiones de aminoácidos contiguos, al menos el 20% de los cuales están expuestos en la superficie. Dos tipos de epítopos resultaron de una comparación de las secuencias de aminoácido con los modelos conformacionales: las especies-especificas, que se caracterizan por una gran variabilidad, y las muy conservadas, que probablemente están más implicadas en la reactividad cruzada entre profilinas de diferentes plantas. Las alineaciones de secuencias de aminoácidos reflejan los resultados del estudio de Fedorov (22) , que evidencia dos posibles epítopos lineales en el N-terminal, tres en la región entre los residuos 30 y 80 y dos adicionales en el C-terminal de la profilina. Todas estas regiones están muy conservadas en las profilinas de las plantas evaluadas en este estudio. La predicción de potenciales epítopos conformacionales se basó en el análisis de un modelo 3D para la profilina de látex Hev b 8. El análisis evidenció 12 residuos salientes, seleccionados como centros de los epítopos. Aunque todos los posibles epítopos fueron conformacionales, estos contenían secuencias lineales y también residuos conservados o variables. No se reportó ninguna prueba en este estudio para confirmar la capacidad de unión al IgE específico de los epítopos propuestos.

Una publicación más reciente se refiere a la identificación de epítopos de IgE de profilina... [Seguir leyendo]

1. Una proteína hipoalergénica que es una variante de secuencia del alérgeno principal de Bet v 2 y que se caracteriza por:

a) reactividad reducida ante las IgE en comparación con el alérgeno Bet v 2 silvestre (sec. con núm. de ident.:1) ; y b) una secuencia de aminoácidos que:

i. es al menos 90% idéntica a la sec. con núm. de ident.:1; y

ii. en una alineación de secuencia con la sec. con núm. de ident.:1, presenta al menos una sustitución de los residuos de Ser o Lys que coinciden con Ser39, Lys 45, Lys88º Lys89 en la sec. con núm. de ident.:1.

2. Una proteína hipoalergénica de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.:1 es al menos 93%.

3. Una proteína hipoalergénica de acuerdo con la reivindicación 2, en donde dicha identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.:1 es al menos 97%.

4. Una proteína hipoalergénica de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dichos residuos de Ser o Lys se sustituyen con aminoácidos neutros, polares o acídicos .

5. Una proteína hipoalergénica de acuerdo con la reivindicación 4, en donde dichos aminoácidos neutros, polares o acídicos se seleccionan de Ala, Gly, Pro, Leu, Ile, Phe, Thr, Ser, Glu, Asp.

6. Una proteína hipoalergénica de acuerdo con la reivindicación 5, en donde dichos aminoácidos son Ala, Thr, Ser, Gly, Glu, Asp.

7. Una proteína hipoalergénica de acuerdo con la reivindicación 1, que se selecciona del grupo que consiste de sec. con núm. de ident.:2 - 6.

8. Un fragmento peptídico de la proteína hipoalergénica de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho fragmento peptídico (i) es capaz de provocar una respuesta inmune independiente de IgE, (ii) consiste de entre 15 y 35 aminoácidos y (iii) porta al menos una de las sustituciones indicadas.

9. Un fragmento peptídico de acuerdo con la reivindicación 8, que consiste de entre 15 y 20 aminoácidos.

10. Una molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína de acuerdo con las reivindicaciones 1-7 o para un péptido de acuerdo con las reivindicaciones 8-9.

11. Una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 10, que se selecciona del grupo que consiste de las sec. con núms. de ident.:8 - 12.

12. Un vector que contiene la molécula de ácido nucleico de las reivindicaciones 10-11.

13. Una célula huésped que contiene el vector de la reivindicación 12.

14. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de una proteína hipoalergénica de acuerdo con las reivindicaciones 1-7, o un fragmento peptídico de acuerdo con las reivindicaciones 8-9, junto con vehículos y excipientes farmacéuticamente aceptables .

15. Una composición de acuerdo con la reivindicación 14, la cual está en forma de una vacuna.

16. Uso de una proteína hipoalergénica de acuerdo con la reivindicaciones 1-7, o un fragmento peptídico de acuerdo con las reivindicaciones 8-9, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento profiláctico o terapéutico de enfermedades alérgicas.

17. El uso de de acuerdo con la reivindicación 16, para el tratamiento de asma bronquial y conjuntivitis alérgica.