VARIANTES DE NS1 DE PARVOVIRUS.

Utilización de una variante de NS1 de parvovirus que presenta un equilibrio desplazado entre las actividades de replicación del ADN y de transcripción (a) y la actividad de citotoxicidad (b),

en la que uno o varios sitios de fosforilación se mutan por sustitución de aminoácidos, provocando el desplazamiento del equilibrio, y

(i) las actividades (a) se reducen o se eliminan, y la actividad (b) se mantiene o se incrementa, o

(ii) las actividades (a) se mantienen y la actividad (b) se reduce o se elimina, para la preparación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento de enfermedades tumorales

Variantes de NS1 de parvovirus.

La presente invención se refiere a la utilización de variantes de NS1 de parvovirus, según se caracteriza adicionalmente en las reivindicaciones. De esta manera, se refiere a la utilización de una variante de NS1 de parvovirus que presenta un equilibrio desplazado entre las actividades de replicación y transcripción del ADN (a) y la actividad de citotoxicidad (b), en la que uno o varios sitios de fosforilación se mutan mediante sustitución de aminoácidos, provocando el desplazamiento del equilibrio, y

(i) las actividades (a) se reducen o se eliminan, y la actividad (b) se mantiene o se incrementa, o

(ii) las actividades (a) se mantienen, y la actividad (b) se reduce o se elimina, para la preparación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento de enfermedades tumorales.

El término "parvovirus" se refiere a un género de la familia de virus Parvoviridae. El género parvovirus comprende varios virus icosaédricos pequeños que pueden replicarse en ausencia de un virus ayudante. Los parvovirus contienen un ADN de una sola cadena que presenta una longitud de aproximadamente 5.000 pb. En cada uno de los extremos 3' y 5' del ADN existe una secuencia palindrómica. El ADN codifica dos proteínas de la cápside, VP1 y VP2, así como dos proteínas no estructurales reguladoras, NS-1 y NS-2. Estas últimas proteínas se encuentran fosforiladas y muestran una localización nuclear, o citoplasmática y nuclear, respectivamente. La proteína NS1 resulta necesaria para la replicación del ADN vírico y participa en la regulación de la expresión génica del virus. En particular, NS1 transactiva el promotor P38 y las actividades de unión a ADN, de helicasa y de formación de muescas en el ADN. Además, NS1 induce estrés citotóxico y/o citostático en células-huésped sensibles.

Los parvovirus habitualmente son bien tolerados por las poblaciones de su huésped natural, en el que persisten sin indicios patológicos evidentes. Esto se debe tanto a la protección de los fetos y neonatos gracias a la inmunidad materna, como a la inesperada restricción de la replicación de los parvovirus a un estrecho abanico de tejidos diana en proliferación en animales adultos. Esta tolerancia del huésped se refiere especialmente a parvovirus de roedor, por ejemplo el virus minúsculo del ratón (MVM) y el virus H-1 en sus huéspedes naturales respectivos, es decir en ratones y ratas. Además, el ser humano puede resultar infectado por estos últimos virus, sin ninguna evidencia de efectos perjudiciales asociados en los estudios epidemiológicos y ensayos clínicos existentes. Por otra parte, es conocido que determinados parvovirus, y especialmente parvovirus de roedor, son tanto oncotrópicos, es decir se acumulan preferentemente en tejidos neoplásicos y no normales, como oncosupresores, es decir presentan un efecto supresor tumoral de las células tumorales, en diversos modelos animales. Por lo menos parte del efecto oncosupresor se cree que se debe a una acción oncolítica directa mediada por NS1. Este efecto oncosupresor también ha sido demostrado contra células tumorales humanas trasplantadas en animales receptores.

Se ha considerado la utilización de parvovirus con fines terapéuticos. Por una parte aparentemente resulta de interés utilizar parvovirus como vectores para genes terapéuticos, es decir para introducir dichos genes en el genoma de las células. Por otra parte, se ha considerado la utilización de NS1 de parvovirus como toxina para el tratamiento de enfermedades tumorales. Sin embargo, los experimentos iniciales han proporcionado resultados insatisfactorios.

Por lo tanto, el objetivo de la presente invención es proporcionar un producto con el que los parvovirus y la proteína NS1 de los mismos, respectivamente, puedan utilizarse para los fines anteriormente indicados.

Según la invención, lo anterior se consigue mediante la materia definida en las reivindicaciones.

La presente invención se basa en los resultados del solicitante de que resulta posible interferir en las actividades de NS1 de parvovirus de manera que se desplace el equilibrio existente entre las actividades de replicación y de transcripción del ADN (a) y la actividad de citotoxicidad (b). En particular, las variantes de NS1 de parvovirus producidas, en las que las actividades de replicación del ADN y de transcripción (a) se reducen y se eliminan, respectivamente, mientras que la actividad de citotoxicidad (b) se mantiene o se incrementa. Además, las variantes de NS1 de parvovirus producidas, en las que la actividad de citotoxicidad (b) se reduce y se elimina, respectivamente, mientras que las actividades de replicación del ADN y de transcripción (a) se mantienen o se incrementan. Se indican ejemplos de dichas variantes de NS1 de parvovirus en la Tabla 1 y en la figura 1. Además, el solicitante reconoce que las variantes de NS1 de parvovirus anteriormente indicadas y los vectores de expresión que codifican las mismas, particularmente los parvovirus, respectivamente, resultan adecuados para fines terapéuticos.

Li et al., Journal of Virology 64:4654-60, 1990, han estudiado el efecto de una mutación de la lisina 405 a serina en NS1 del parvovirus H-1 sobre la replicación del ADN, la transactivación del promotor tardío y la citotoxicidad. Nüesch et al., Journal of Virology 72:8002-12, 1998, han estudiado la función de NS1 y afirman que se desconoce qué sitios de fosforilación en NS1 resultan relevantes para la activación de la función replicativa de NS1. Sin embargo, ninguno de los dos artículos informa de la utilización de variantes de NS1 de parvovirus que presenten mutaciones particulares en los sitios de fosforilación, destinadas al tratamiento de enfermedades tumorales.

Según la invención, los resultados del solicitante se utilizan para proporcionar un uso particular de una variante de NS1 de parvovirus según se define en las reivindicaciones.

La expresión "parvovirus" comprende cualquier parvovirus, particularmente un parvovirus de roedor, tal como el virus minúsculo del ratón (MVM) y el virus H-1.

La expresión "se encuentra desplazado el equilibrio entre las actividades de replicación y transcripción del ADN (a) y la actividad de citotoxicidad (b)" se refiere al hecho de que, en una variante de NS1 de parvovirus según la invención, dicho equilibrio se encuentra desplazado en comparación con la NS1 de parvovirus de tipo salvaje. En particular, el equilibrio puede encontrarse desplazado de manera que el efecto sea que las actividades de replicación y transcripción del ADN (a) se reduzcan y se eliminen, respectivamente, mientras que la actividad de citotoxicidad (b) se mantiene o se incrementa. La actividad de citotoxicidad (b) también puede reducirse y eliminarse, respectivamente, mientras que las actividades de replicación y transcripción del ADN (a) se mantienen o se incrementan. Este equilibrio puede determinarse mediante diversos métodos. Con respecto a la determinación de la actividad de replicación del ADN, se hace referencia a, por ejemplo, los métodos descritos en Legendre y Rommelaere, J. Virol. 66:5705, 1992; Cotmore et al., Virology 190:365, 1992; Cotmore et al., J. Virol. 67:1579, 1993; Cotmore y Tattersall, Embo. J. 13:4145, 1994. Respecto a la determinación de la actividad de transcripción, se hace referencia a los métodos descritos en, por ejemplo, Rhode y Richards, J. Virol. 61:2807, 1987. Con respecto a la determinación de la actividad de citotoxicidad se hace referencia a los ejemplos proporcionados posteriormente.

Según la invención, se utilizan variantes de NS1 de parvovirus en las que el desplazamiento del equilibrio se consigue mediante la mutación de uno o varios sitios de fosforilación. Resultan particularmente preferentes los variantes de NS1 de parvovirus que presentan una mutación en uno o varios de los sitios de fosforilación 283, 363, 394 y 463. Resultan todavía más preferentes las variantes de NS1 de parvovirus S283A, T363A, T394A y T463A, que se indican en la Tabla 1 y en la figura 1. En S283A, se intercambia una serina por una alanina en la posición 283, en T363A se intercambia una treonina por alanina en la posición 363, y en T394A se intercambia una treonina por alanina en la posición 283, en T363A se intercambia una treonina por alanina en la posición 363, en T394A se intercambia una treonina por alanina en la posición 394, y en T463A se intercambia una treonina por alanina en la posición 463.

El ADN de variantes de NS1 de parvovirus particulares se ha depositado en el DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)...

1. Utilización de una variante de NS1 de parvovirus que presenta un equilibrio desplazado entre las actividades de replicación del ADN y de transcripción (a) y la actividad de citotoxicidad (b), en la que uno o varios sitios de fosforilación se mutan por sustitución de aminoácidos, provocando el desplazamiento del equilibrio, y

(i) las actividades (a) se reducen o se eliminan, y la actividad (b) se mantiene o se incrementa, o

(ii) las actividades (a) se mantienen y la actividad (b) se reduce o se elimina, para la preparación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento de enfermedades tumorales.

2. Utilización según la reivindicación 1, en la que la variante de NS1 de parvovirus se expresa mediante un vector de expresión que comprende un ADN codificante de la variante de NS1 de parvovirus.

3. Utilización según la reivindicación 2, en la que el vector de expresión es H1 de parvovirus.

4. Utilización según la reivindicación 1, en la que las mutaciones se encuentran localizadas en los sitios 283, 363, 394 y/o 463.

5. Utilización según la reivindicación 4, es decir las variantes S283A, T363A, T394A y T463A de NS1.