Una variante de la hormona del crecimiento humana que comprende el siguiente grupo de sustituciones de aminoácidos:

H18D, H21N, R167N, K168A, D171S, K172R, E174S, I179T

Variantes de la hormona de crecimiento humano.

Antecedentes de la invención

Esta invención se refiere a ciertas variantes de la hormona del crecimiento, y formas pegiladas de las mismas, para su uso como agonistas o antagonistas de la hormona de crecimiento humana.

La hormona del crecimiento humana (hGH) participa en la regulación del crecimiento y el desarrollo humano normal. Esta hormona de la pituitaria de 22.000 dalton manifiesta una multitud de efectos biológicos, incluyendo el crecimiento lineal (somatogénesis), la lactancia, la activación de macrófagos, y los efectos de tipo insulina y diabetogénicos, entre otros. Chawla, Annu. Rev. Med., 34: 519 (1983); Edwards et al, Science, 239: 769 (1988); Isaksson et al, Annu. Rev. Physiol., 47: 483 (1985); Thorner y Vance, J. Clin. Invest., 82: 745 (1988); Hughes y Friesen, Annu. Rev. Physiol., 47: 469 (1985). Estos efectos biológicos derivan de la interacción entre la hGH y receptores celulares específicos. La deficiencia en hormona del crecimiento en niños conduce al enanismo, que ha sido tratado con éxito durante más de una década mediante la administración exógena de hGH. Asimismo existe interés en la antigenicidad de la hGH para distinguir entre las formas de hGH genéticas y las modificadas post-traduccionalmente (Lewis, Ann. Rev. Physiol., 46: 33 (1984)], para caracterizar cualquier respuesta inmunológica a hGH cuando es administrada clínicamente, y para cuantificar los niveles circulantes de la hormona.

La hGH es miembro de una familia de hormonas homólogas que incluyen lactógenos placentarios, prolactinas, y otras variantes genéticas y de la especie de la hormona del crecimiento. Nichol et al, Endocrine Reviews, 7: 169 (1986). La hGH es inusual entre estas ya que manifiesta una amplia especificidad de especie y se une o bien al receptor somatogénico clonado (Leung et al, Nature, 330: 537 [1987]) o bien al de la prolactina (Boutin et al, Cell, 53: 69 [1988]). El gen clonado para la hGH ha sido expresado en una forma secretada en E. coli (Chang et al, Gene, 55: 189 [1987]) y se ha informado sobre sus secuencias de ADN y de aminoácidos. Goedel et al, Nature, 281: 544 (1979); Gray et al, Gene, 39: 247 (1985). El patrón de plegamiento tridimensional para la hormona del crecimiento porcina (pGH) ha sido referido con una resolución y una sutileza moderadas. Abdel-Meguid et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 6434 (1987). Se han identificado los epitopos del receptor y el anticuerpo de hGH mediante mutagénesis de barrido de homólogos y mutagénesis de barrido con alanina como se describe en la solicitud de prioridad de esta solicitud y en Cunningham et al, Science, 243: 1330-1336 (1989) y Cunningham y Wells, Science, 244: 1081-1085 (1989).

Existen un gran número de estructuras de alta resolución que muestran los detalles moleculares de las interfases proteína-proteína (para revisiones, ver Argos, Protein Eng., 2.: 101-113 [1988]; Janin et al, J. Mol. Biol., 204: 155-164 [1988]; Miller, Protein Eng., 3: 77-83 [1989]; Davies et al, Annu. Rev. Biochem., 59: 439-473). Estas definen los restos en contacto, pero no la energía de los mismos ni muestran cómo se produce el acoplamiento. Un conocimiento comprensivo del papel de los restos en contacto que afectan a la asociación y la disociación es fundamental para los procedimientos de reconocimiento molecular, y es importante desde el punto de vista práctico para el diseño racional de proteínas y fármacos.

Quizás el complejo hormona-receptor mejor caracterizado es aquél entre hGH y el dominio extracelular de su receptor (hGHbp). Para una revisión, ver Wells y De Vos, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 22: 329-351 (1993). Los análisis estructurales de alta resolución y mutacionales (Cunningham y Wells, supra; Cunningham et al, Science, 254: 821-825 [1991]) y los análisis estructurales [De Vos et al, Science, 255: 306-3012 [1992]) han demostrado que una molécula de hGH se une a dos moléculas de receptor sucesivamente utilizando sitios distintos sobre la hormona, denominados Sitios 1 y 2.

Se han identificado numerosos mutantes de origen natural de hGH. Entre estos se incluyen hGH-V [Seeberg, DNA, 1: 239 (1982); Patentes de los Estados Unidos Núms. 4.446.235, 4.670.393, y 4.665.180] y hGH de 20 K conteniendo una deleción de los restos 32-46 de la hGH. Kostyo et al, Biochem. Biophys. Acta, 925:314 (1987); Lewis et al, J. Biol. Chem., 253: 2679 (1978).

Un investigador ha informado sobre la sustitución de la cisteína de la posición 165 en la hGH por alanina para desorganizar el enlace disulfuro que existe normalmente entre la Cys-53 y la Cys 165. Tokunaga et al, Eur. J. Biochem., 153: 445 (1985). Esta única sustitución producía un mutante que aparentemente conservaba la estructura terciaria de la hGH y era reconocido por los receptores de hGH.

Otro investigador ha informado sobre la síntesis in vitro de hGH en un soporte de resina sólido. El primer informe de este investigador describia una secuencia de 188 aminoácidos incorrecta para hGH. Li et al, J. Am. Chem. Soc., 88:2050 (1966); Patente de los Estados Unidos Núm. 3.853.832. Un segundo informe describía una secuencia de 190 aminoácidos. Patente de los Estados Unidos Núm. 3.853.833. Esta última secuencia también es incorrecta. En particular, la hGH tiene una glutamina adicional tras la posición 68, un ácido glutámico en lugar de glutamina en la posición 73, un ácido aspártico en lugar de asparragina en la posición 106, y una asparragina en lugar de ácido aspártico en la posición 108.

Además de lo anterior, se ha informado sobre interferones híbridos que tienen alterada la unión a un anticuerpo monoclonal concreto. Camble et al, "Properties of Interferon-a2 Analogues Produced form Synthetic Genes" en Peptides: Structure and Function, Proceedings of the Ninth American Peptide Symposium, Deber et al, eds. (Pierce Chemical Co., Chicago, Ill. 1985), págs. 375-384. Como se ha descrito allí, los restos aminoácido 101-114 del interferón a-1 o los restos 98-114 del interferón ? fueron sustituidos en el interferón a-2. El interferón a-2 se une al anticuerpo monoclonal NK-2, mientras que el interferón a-1 no. Esta región concreta del interferón a-2 fue elegida aparentemente debido a que 7 de las 27 diferencias de aminoácidos entre el interferón a-1 y el a-2 estaban localizadas en esta región. Se dice que los híbridos así obtenidos tenían sustancialmente reducida la actividad con el anticuerpo monoclonal NK-2. Cuando se sometía a ensayo la actividad antiviral, tales híbridos demostraban actividad antiviral equivalente a la actividad del interferón a-2 de tipo salvaje. También se ha informado sobre sustituciones de secciones más pequeñas en estas regiones. Asimismo se propuso la sustitución sucesiva de agrupaciones de 3 a 7 restos alanina. No obstante, sólo se describió un IFN-a2 análogo [Ala-30,32,33].

Asimismo se ha informado sobre la sustitución de alanina en un fragmento peptídico pequeño de lisozima de clara de huevo de gallina y el efecto de tales sustituciones sobre la estimulación de las células 2A11 o 3A9. Allen et al, Nature, 327: 713-715 (1987).

Otros han informado de que las propiedades de unión pueden ser diseñadas mediante la reposición de unidades completas de estructura secundaria incluyendo bucles de unión al antígeno (Jones et al, Nature, 321: 522-525 o hélices de reconocimiento de ADN. Wharton et al, Nature, 316: 601-605 (1985).

Se ha mostrado la estructura de la hormona de crecimiento bovina (bGH) metionilada en el amino terminal que contiene una secuencia empalmada de hGH incluyendo la histidina 18 y la histidina 21. Patente de los Estados Unidos Núm. 4.880.910. Las variantes de hGH adicionales se describen en las solicitudes de prioridad de esta solicitud y en el documento U.S copendiente con los Núms. de Serie 07/715.300 presentado el 14 de Junio de 1991 y 07/743.614 presentado el 9 de Agosto de 1991, y el documento WO 92/09690 publicado el 11 de Junio de 1992. Asimismo se describen variantes de hGH (documento WO 93/00109 publicado el 7 de Enero de 1993) que tienen el radical de la GH...

1. Una variante de la hormona del crecimiento humana que comprende el siguiente grupo de sustituciones de aminoácidos: H18D, H21N, R167N, K168A, D171S, K172R, E174S, I179T.

2. La variante de la hormona del crecimiento humana de la reivindicación 1, donde la variante de la hormona del crecimiento humana está conjugada con uno o más grupos químicos que incrementan el peso molecular real de la variante de la hormona del crecimiento humana hasta entre 30 y aproximadamente 100 kilodaltons.

3. La variante de la hormona del crecimiento humana de la reivindicación 2, donde dicho grupo químico es poli(etilenglicol).

4. La variante de la hormona del crecimiento humana de la reivindicación 3, donde el poli(etilenglicol) tiene un peso molecular medio de entre 500 y aproximadamente 30.000 daltons.

5. La variante de la hormona del crecimiento humana de la reivindicación 4, donde el poli(etilenglicol) tiene un peso molecular medio de aproximadamente 5.000 daltons.

6. La variante de la hormona del crecimiento humana de la reivindicación 4, donde el poli(etilenglicol) tiene un peso molecular medio de aproximadamente 20.000 daltons.

7. La variante de la hormona del crecimiento humana de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, donde dicha variante de la hormona del crecimiento humana está conjugada con entre aproximadamente cuatro y aproximadamente seis moléculas de poli(etilenglicol).

8. El uso de la variante de la hormona del crecimiento humana de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que es una variante agonística de la hormona de crecimiento humana, en la fabricación de un medicamento para incrementar el anabolismo o el crecimiento en un paciente.

9. El uso de acuerdo con la reivindicación 8, donde dicho paciente padece síndrome de Turner, deficiencia de hormona de crecimiento (GH), crecimiento lento o retardado, respuesta de IgF-1 a GH químicamente o naturalmente reducida, o trastornos inmunitarios incluyendo envejecimiento, quimioterapia o terapia con radiación, recuperación de una enfermedad principal, preparación para cirugía, SIDA, deficiencias congénitas y adquiridas de células B.

10. La variante de la hormona de crecimiento humana de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que tiene una sustitución de aminoácido adicional en G120 que interrumpe la unión del sitio 2 a un receptor de la hormona de crecimiento.

11. El uso de la variante de la hormona de crecimiento humana de la reivindicación 10, en la fabricación de un medicamento para inhibir la acción de la hormona de crecimiento en un paciente.

12. El uso de acuerdo con la reivindicación 11, donde el paciente tiene acromegalia, gigantismo, diabetes y sus complicaciones incluyendo retinopatía diabética y nefropatía diabética, enfermedades oculares vasculares que implican neovascularización proliferativa y malignidades sensibles a GH.

13. El uso de acuerdo con la reivindicación 11, donde el paciente tiene un tumor de Wilm, sarcomas que incluyen sarcoma osteogénico, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer de tiroides, linfoma de Burkitt, carcinoma de pulmón, carcinoma colorrectal, leucemia linfoblástica y melanoma.

14. Una secuencia de ácido nucleico que codifica la variante de la hormona de crecimiento humana de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 10.

15. Un vector que comprende la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 14.

16. Una célula anfitriona aislada que comprende el vector de la reivindicación 15.

17. Un procedimiento para preparar una variante de la hormona de crecimiento humana que comprende cultivar la célula anfitriona de la reivindicación 16 y recuperar la variante de la hormona de crecimiento humana del cultivo.

18. Un método para producir una variante de la hormona del crecimiento humana pegilada, que comprende:

19. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de una variante de la hormona del crecimiento humana según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y 10.

20. La composición farmacéutica de la reivindicación 19, que comprende también un portador, excipiente o estabilizador farmacéutico.

21. La composición farmacéutica de la reivindicación 20, donde dicho portador farmacéutico puede ser seleccionado entre glicina, manitol y fosfato.