USO DE UNA SECUENCIA DE NUCLEOTIDOS QUE CODIFICA LA ENZIMA I-SCE I.

SE PROPORCIONA UN ADN AISLADO, QUE CODIFICA PARA LA ENZIMA ISCEI.

DICHA SECUENCIA DE ADN, PUEDE SER INCORPORADA EN VECTORES DE CLONAJE Y EXPRESION, LINEAS CELULARES TRANSFORMADAS Y ANIMALES TRANSGENICOS. LOS CITADOS VECTORES, SON UTILES PARA EL MAPEADO GENETICO Y LA INSERCION DIRIGIDA DE GENES

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP95/04351.

Solicitante: INSTITUT PASTEUR
UNIVERSITE PIERRE ET MARIE CURIE
.

Nacionalidad solicitante: Francia.

Dirección: 25-28, RUE DU DOCTEUR ROUX,75724 PARIS CEDEX 15.

Inventor/es: CHOULIKA, ANDRE, NICOLAS, JEAN-FRANCOIS, PERRIN,ARNAUD, DUJON,BERNARD.

Fecha de Publicación: .

Fecha Concesión Europea: 30 de Diciembre de 2009.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N15/66 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Métodos generales para insertar un gen en un vector para formar un vector recombinante, utilizando la escisión y la unión; Utilización de "linkers" no funcionales o de adaptadores, p. ej. "linkers" que contienen la secuencia para una endonucleasa de restricción.
  • C12N9/22 C12N […] › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › Ribonucleasas.

Clasificación PCT:

  • A01K67/027 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A01 AGRICULTURA; SILVICULTURA; CRIA; CAZA; CAPTURA; PESCA.A01K CRÍA DE ANIMALES; AVICULTURA; APICULTURA; PISCICULTURA; PESCA; ANIMALES PARA CRIA O REPRODUCCIÓN, NO PREVISTOS EN OTRO LUGAR; NUEVAS VARIEDADES DE ANIMALES.A01K 67/00 Cría u obtención de animales, no prevista en otro lugar; Nuevas razas de animales. › Nuevas razas de vertebrados.
  • C12N15/11 C12N 15/00 […] › Fragmentos de ADN o de ARN; sus formas modificadas (ADN o ARN no empleado en tecnología de recombinación C07H 21/00).
  • C12N15/66 C12N 15/00 […] › Métodos generales para insertar un gen en un vector para formar un vector recombinante, utilizando la escisión y la unión; Utilización de "linkers" no funcionales o de adaptadores, p. ej. "linkers" que contienen la secuencia para una endonucleasa de restricción.
  • C12N5/10 C12N […] › C12N 5/00 Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00). › Células modificadas por introducción de material genético extraño, p. ej. células transformadas por virus.

Clasificación antigua:

  • A01K67/027 A01K 67/00 […] › Nuevas razas de vertebrados.
  • C12N15/11 C12N 15/00 […] › Fragmentos de ADN o de ARN; sus formas modificadas (ADN o ARN no empleado en tecnología de recombinación C07H 21/00).
  • C12N15/66 C12N 15/00 […] › Métodos generales para insertar un gen en un vector para formar un vector recombinante, utilizando la escisión y la unión; Utilización de "linkers" no funcionales o de adaptadores, p. ej. "linkers" que contienen la secuencia para una endonucleasa de restricción.
  • C12N5/10 C12N 5/00 […] › Células modificadas por introducción de material genético extraño, p. ej. células transformadas por virus.
USO DE UNA SECUENCIA DE NUCLEOTIDOS QUE CODIFICA LA ENZIMA I-SCE I.

Fragmento de la descripción:

Uso de una secuencia de nucleótidos que codifica la enzima I-Sce I.

Antecedentes de la invención

Esta solicitud divulga una secuencia de nucleótidos que codifica la endonucleasa de restricción I-SceI. Esta solicitud también describe vectores que contienen la secuencia de nucleótidos, células transformadas con los vectores, animales transgénicos con base en los vectores, y líneas de células derivadas de células en los animales. Esta solicitud también describe el uso de I-Sce I para el mapeo de genomas de eucariotas y para recombinación genética in vivo dirigida al sitio.

La habilidad para introducir genes en la línea germinal de mamíferos es de gran interés en biología. La propensión de células de mamífero para tomar ADN añadido en forma endógena y para expresar genes incluidos en el ADN se conoce desde hace muchos años. Los resultados de la manipulación genética son heredados por la descendencia de estos animales. Las células de estos descendientes heredan el gen introducido como parte de su carga genética. Se dice que tales animales son transgénicos.

Los mamíferos transgénicos han suministrado una forma de estudiar la regulación de los genes durante la embriogénesis y en la diferenciación, para estudiar la acción de los genes, y para estudiar la intrincada interacción de las células en el sistema inmunológico. El animal completo es el sistema último de análisis para genes manipulados, que dirigen un proceso biológico complejo.

Los animales transgénicos pueden proporcionar un ensayo general para analizar funcionalmente minuciosamente secuencias de ADN responsables de la regulación específica o de desarrollo del tejido de una variedad de genes. Además, los animales transgénicos proporcionan vehículos útiles para expresar proteínas recombinantes y para generar modelos animales precisos de trastornos genéticos humanos.

Para una discusión general de clonación y expresión génica en animales y en células de animales, ver Old and Primrose, "Principles of Gene Manipulation," Blackwell Scientific Publications, Londres (1989), página 255 y subsiguientes.

Las líneas transgénicas, que tienen una predisposición a enfermedades específicas y trastornos genéticos, son de gran valor en la investigación de los eventos que conducen a estos estados. Es bien conocido que la eficacia del tratamiento de un trastorno genético puede depender de la identificación del defecto genético que es la causa principal del trastorno. El descubrimiento de tratamientos efectivos se puede acelerar suministrando un modelo animal que conducirá a la enfermedad o al trastorno, lo cual permitirá el estudio de la eficacia, seguridad y modo de acción de los protocolos de tratamiento, tal como la recombinación genética.

Uno de los tejidos clave para la comprensión de la recombinación genética es la naturaleza de la etapa de iniciación. Los estudios de recombinación homóloga en bacterias y en hongos han dado lugar a la propuesta de dos tipos de mecanismos de iniciación. En el primer modelo, un corte de la cadena monocatenaria inicia la asimilación de la cadena y la migración de la rama (Meselson y Radding, 1975). Alternativamente, puede ocurrir un rompimiento bicatenario, seguido por un mecanismo de reparación que utiliza una secuencia homóloga no escindida como molde (Resnick y Martin, 1976). Este último modelo ha ganado soporte a partir del hecho de que se incrementa dramáticamente la transformación integradora en levadura cuando el plásmido transformante se linealiza en la región de homología cromosómica (Orr-Weaver, Szostak y Rothstein, 1981) y a partir de la observación directa de un rompimiento bicatenario durante la interconversión de tipo apareamiento (Strathern y colaboradores, 1982). Recientemente, los rompimientos bicatenarios también han sido caracterizados durante recombinación meiótica normal de levadura (Sun y colaboradores, 1989; Alani, Padmore y Kleckner, 1990).

Se han caracterizado diferentes actividades de endonucleasa bicatenaria en levadura: las endonucleasas codificadas por HO y por el intrón están asociadas con funciones de recombinación homóloga, mientras que otras aún tienen funciones genéticas desconocidas (Endo-SceI, Endo-SceII) (Shibata y colaboradores, 1984; Morishima y colaboradores, 1990). La endonucleasa específica del sitio HO inicia la interconversión de tipo apareamiento provocando un rompimiento bicatenario cerca de la unión YZ de MAT (Kostriken y colaboradores, 1983). El rompimiento es posteriormente reparado utilizando las secuencias intactas HML o HMR y resultando en conversión ectópica del gen. El sitio de reconocimiento HO es una secuencia no simétrica degenerada de 24 pb (Nickoloff, Chen, y Heffron 1986; Nickoloff, Singer y Heffron 1990). Esta secuencia ha sido utilizada como un "recombinador" en construcciones artificiales para promover recombinación mitótica y meiótica intra e intermolecular (Nickoloff, Chen y Heffron, 1986; Kolodkin, Klar y Stahl 1986; Ray y colaboradores, 1988, Rudin y Haber, 1988; Rudin, Sugarman, y Haber 1989).

Las endonucleasas específicas de dos sitios, I-Sce I (Jacquier y Dujon, 1985) y I-SceII (Delahodde y colaboradores, 1989; Wenzlau y colaboradores, 1989), que son responsables por la movilidad del intrón en mitocondria, inician una conversión génica que se parece a la conversión inducida por HO (ver Dujon, 1989 para revisión). I-Sce I, que es codificada por el intrón opcional Sc LSU.1 del gen de ARNr 21S, inicia un rompimiento bicatenario en el sitio de inserción del intrón (Macreadie y colaboradores, 1985; Dujon y colaboradores, 1985; Colleaux y colaboradores, 1986). El sitio de reconocimiento de I-Sce I se extiende sobre una secuencia no simétrica de 18 pb (Colleaux y colaboradores, 1988). Aunque las dos proteínas no están obviamente relacionadas por su estructura (HO tiene una longitud de 586 aminoácidos mientras que I-Sce I tiene una longitud de 235 aminoácidos), ambas generan cortes escalonados de 4 pb con proyecciones 3'OH dentro de sus respectivos sitios de reconocimiento. Se ha encontrado que una endonucleasa codificada en el intrón mitocondrial, transcrita en el núcleo y traducida en el citoplasma, genera un rompimiento bicatenario en un sitio nuclear. Los eventos de reparación inducidos por I-Sce I son idénticos a aquellos iniciados por HO.

En resumen, existe la necesidad en el arte de reactivos y métodos para proporcionar modelos de animales transgénicos de enfermedades humanas y trastornos genéticos. Los reactivos se pueden basar en la enzima de restricción I-Sce I y en el gen que codifica esta enzima. En particular, existe la necesidad de reactivos y de métodos para reemplazar un gen natural con otro gen que sea capaz de aliviar la enfermedad o el trastorno genético.

La presente invención cumple con esta necesidad suministrando métodos, animales transgénicos no humanos y células recombinantes como las descritas en el conjunto de las reivindicaciones.

Resumen de la invención

Por lo tanto, esta invención ayuda a satisfacer estas necesidades en el estado del arte. Específicamente, esta solicitud describe un ADN aislado que codifica a la enzima I-SceI. El ADN tiene la siguiente secuencia de nucleótidos:


Esta solicitud también describe una secuencia de ADN que comprende un promotor operativamente enlazado a la secuencia de ADN como se define en este documento, que codifica la enzima I-SceI.

Esta solicitud divulga además a un ARN aislado complementario a la secuencia de ADN como se define en este documento que codifica a la enzima I-Sce I y a las otras secuencias de ADN descritas aquí.

En otra modalidad, se proporciona un vector. El vector comprende un plásmido, bacteriófago, o vector cósmido que contiene la secuencia de ADN como se define aquí, que codifica a la enzima I-SceI.

Además, esta solicitud se relaciona con células eucariotas o de E. coli transformadas con un vector como se define en este documento.

También, esta solicitud se relaciona con animales transgénicos que contienen la secuencia de ADN que codifica la enzima I-Sce I y líneas de células cultivadas a partir de los animales transgénicos.

Esta invención se relaciona con un organismo transgénico en el cual se ha insertado al menos un sitio de restricción para la enzima I-Sce I en un cromosoma del organismo.

La solicitud se relaciona también con un método de mapear genéticamente...

 


Reivindicaciones:

1. Un método para inducir al menos un rompimiento bicatenario dirigido al sitio en ADN cromosómico de células animales, comprendiendo dicho método

(a) suministrar células animales que contengan ADN cromosómico bicatenario;
(b) insertar al menos un sitio de restricción de I-Sce I en dicho ADN cromosómico;
(c) la transfección de dichas células con al menos un plásmido que contiene ADN que codifica la I-Sce I meganucleasa; y
(d) seleccionar células en las cuales se ha inducido al menos un rompimiento bicatenario.

2. El método de la reivindicación 1, en donde dichas células animales son células de mamífero.

3. El método de la reivindicación 2, en donde dicha célula es una célula NIH3T3 que contiene el virus G-MtkPL.

4. El método de la reivindicación 1, en donde dicho plásmido es pCMV (I-Sce I+)

5. Un método para inducir recombinación homóloga entre ADN cromosómico de células animales y ADN exógeno añadido a dicha célula, comprendiendo dicho método

(a) suministrar células animales que contengan ADN cromosómico, en donde dicho ADN comprende al menos un sitio de restricción de I-SceI;
(b) la transfección de dichas células con un plásmido que contiene ADN exógeno, y con un plásmido que contiene ADN que codifica la I-Sce I meganucleasa; y
(c) seleccionar células en las cuales dicho ADN exógeno es insertado dentro de dicho ADN cromosómico.

6. El método de la reivindicación 5, en donde dichas células animales son células de mamífero.

7. El método de la reivindicación 6, en donde dicha célula es una célula NIH3T3 que contiene al virus G-MtkPL.

8. El método de la reivindicación 5, en donde el plásmido que contiene al ADN que codifica a la I-Sce I meganucleasa es pCMV (I-Sce I+).

9. Un método para inducir recombinación homóloga entre ADN cromosómico de una célula animal y ADN exógeno añadido a dicha célula, comprendiendo dicho método

(a) suministrar células animales que contengan ADN cromosómico;
(b) insertar al menos un sitio de restricción de I-Sce I en dicho ADN cromosómico;
(c) la transfección de dichas células con un primer plásmido que contiene ADN exógeno, y con un segundo plásmido que contiene ADN que codifica a la I-Sce I meganucleasa; y
(d) seleccionar células en las cuales dicho ADN exógeno es insertado dentro de dicho ADN cromosómico.

10. El método de la reivindicación 9, en donde dichas células animales son células de mamífero.

11. El método de la reivindicación 9, en donde dicho primer plásmido es pVRneo.

12. El método de la reivindicación 9, en donde dicho segundo plásmido es pCMV (I-Sce I+).

13. Un método para inducir al menos un rompimiento dirigido al sitio en ADN cromosómico de células animales e insertar el ADN que codifica un polipéptido, comprendiendo dicho método

(a) suministrar células animales que contengan ADN cromosómico bicatenario, y transformar dichas células con un ADN que contenga un sitio de restricción de I-Sce I;
(b) añadir enzima I-Sce I o transformar dicha célula con ADN que codifique a la enzima I-Sce I;
(c) la transfección de dichas células con un ADN que codifique un polipéptido o con un vector que contenga dicho ADN; y
(d) seleccionar células en las cuales dicho ADN que codifica dicho polipéptido sea insertado en ADN cromosómico, en donde dichas células expresen dicho polipéptido.

14. Una célula recombinante obtenible por medio del método de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 13, con tal de que dicha célula no sea ni una célula germinal humana ni una célula embrionaria humana.

15. Un animal transgénico no humano que comprende una célula transformada por medio del método de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 13.

16. Un método para expresar un polipéptido en un animal transgénico no humano, comprendiendo dicho método

(a) transformar células madre embrionarias de un animal no humano con un ADN que contiene un sitio de restricción de I-Sce I;
(b) añadir enzima I-Sce I a dicha célula o transformar dicha célula con un vector que contiene al gen que codifica para la enzima I-Sce I;
(c) transfectar dichas células con un ADN que codifica dicho polipéptido, y
(d) detectar la expresión de dicho polipéptido en un animal transgénico no humano que resulta de dichas células madre embrionarias transformadas en las cuales dicho ADN que codifica dicho polipéptido es insertado dentro de dicho ADN cromosómico.

17. Una célula madre recombinante que expresa un polipéptido, en donde dicha célula madre puede obtenerse por medio de

a. el suministro de células madre, en donde dichas células son transformadas por medio de un ADN que contiene un sitio de restricción de I-Sce I;
b. la adición de enzima I-Sce I a dicha célula o transformar dicha célula con un vector que contiene al gen que codifica para la enzima I-Sce I;
c. la transfección de dichas células con dicho ADN que codifica dicho polipéptido, y
d. la selección de células en las cuales dicho ADN que codifica dicho polipéptido es insertado dentro de dicho ADN cromosómico de dichas células, en donde dichas células expresan dicho polipéptido.

con tal de que dicha célula no sea una célula embrionaria humana.

18. Una célula recombinante como la reivindicada en la reivindicación 14, en donde dicho polipéptido es un antígeno foráneo a la célula.

19. Una célula recombinante como la reivindicada en la reivindicación 14, en donde dicha célula es una línea de células de mamífero.

20. Una célula recombinante como la reivindicada en la reivindicación 14, en donde dicha célula es una célula humana del tejido hematopoyético, un hepatocito, una célula de piel, una célula endotelial de vaso sanguíneo o una célula madre.


 

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