USO DE POLISACARIDOS BACTERIANOS PARA LA INHIBICION DE BIOPELICULAS.

Uso de un polisacárido capsular soluble del tipo del grupo II procedente de una cepa bacteriana,

para la preparación de una composición que previene o inhibe la adhesión bacteriana y/o el desarrollo de biopelículas bacterianas

Uso de polisacáridos bacterianos para la inhibición de biopelículas.

La presente invención pertenece al campo de la prevención de biopelículas. Más particularmente, la invención proporciona nuevos componentes que pueden prevenir y/o inhibir la formación de biopelículas bacterianas en varias superficies.

Una biopelícula es una acumulación de microorganismos embebidos en una matriz de polisacáridos y adherente a una superficie biológica o no biótica. En estas biopelículas pueden encontrarse diversos microorganismos (bacterias, hongos y/o protozoos, con bacteriófagos asociados y otros virus). Las biopelículas son ubicuas en la naturaleza y se encuentran comúnmente en una amplia serie de ambientes, incluyendo los sistemas de agua domésticos e industriales.

Las biopelículas son también agentes etiológicos para varias enfermedades en mamíferos. Los ejemplos incluyen infecciones de los tejidos blandos orales, dientes, oído medio, tracto gastrointestinal, tracto urogenital, tejido de vías respiratorias/pulmonar, membrana peritoneal y los ojos. Las biopelículas también se desarrollan en dispositivos intravasculares médicos, tales como implantes dentales, prótesis del tracto urinario, catéteres de diálisis peritoneal, catéteres permanentes para hemodiálisis y para la administración crónica de agentes quimioterapéuticos (catéteres de Hickman), implantes cardiacos tales como marcapasos, válvulas protésicas del corazón, dispositivos de asistencia ventricular (DAV), injertos y endoprótesis vasculares sintéticas, prótesis, dispositivos de fijación interna, suturas percutáneas y tubos traqueales y de ventilación.

El desarrollo de biopelículas en dispositivos industriales tales como sistemas de agua o plantas agroalimentarias también provoca problemas de seguridad.

Las bacterias planctónicas (es decir, bacterias unicelulares suspendidas en medio líquido) generalmente se usan como modelos para investigación y diseño de antibióticos. Sin embargo, las bacterias en las biopelículas son mucho más resistentes a antibióticos que sus homólogas planctónicas, y menos accesibles para el sistema inmune. Además, la conjugación se produce a una mayor proporción entre las células de las biopelículas que entre las células planctónicas. Esta mayor oportunidad de transferencia genética entre bacterias es importante, ya que las bacterias resistentes a agentes antimicrobianos o a biocidas químicos pueden transferir los genes de resistencia a bacterias vecinas susceptibles. La transferencia genética también puede convertir un organismo comensal avirulento previo en un patógeno altamente virulento.

La formación de biopelículas no está limitada a la unión de bacterias a una superficie. De hecho, cuando se aumenta en profundidad, las bacterias de las biopelículas interaccionan más entre ellas que con el sustrato físico real en el que se desarrolló la película inicialmente. En una biopelícula, las bacterias pueden comunicarse por medio de mecanismos de señalización química, de forma que la comunidad experimenta cambios fenotípicos cuando se alcanza una densidad mínima (el quórum) en la biopelícula. Este fenómeno, llamado "quórum sensing" ("lenguaje químico de las bacterias"), puede ser responsable de la expresión de factores de virulencia.

Además de polisacáridos relacionados con las biopelículas de E. coli tales como polímero de ácido colánico, celulosa y (1-6) ß-N-acetilglucosamina, los aislados de E. coli también producen dos polisacáridos seroespecíficos de superficie: el lipopolisacárido (LPS) antígeno O y el polisacárido capsular, antígeno K. Estas dos clases de polímeros polisacarídicos expuestos de superficie han demostrado jugar papeles indirectos en las biopelículas por medio de la protección de la adhesina de la superficie bacteriana (Schembri et al., 2004).

Las estrategias descritas hasta la fecha para prevenir y/o romper las biopelículas están principalmente basadas en inhibidores del quórum sensing (Schachter, 2003).

La presente invención proporciona una novedosa estrategia para inhibir la formación de biopelículas, ya que los inventores han demostrado, usando biopelículas bacterianas de especies mezcladas in vitro, que algunas bacterias liberan en el cultivo sobrenadante un polisacárido capsular soluble del grupo II que previene la formación de biopelículas de una amplia serie de bacterias Gram-negativas y Gram-positivas. Como se describe en la parte experimental más abajo, estos componentes capsulares inducen alteraciones físico-químicas de la superficie, llevando a una reducción de la superficie celular y de los contactos célula-célula que limitan tanto la adhesión inicial como el desarrollo de la biopelícula bacteriana.

Un primer objeto de la presente invención es, por lo tanto, el uso de un polisacárido capsular soluble del tipo del grupo II procedente de una cepa bacteriana, para la preparación de una composición que prevenga o inhiba la adhesión de microorganismos y/o el desarrollo de biopelículas, en particular la adhesión bacteriana y/o el desarrollo de biopelículas bacterianas. En lo que sigue, el término "polisacárido", aunque se usa en el singular, puede designar una mezcla de diferentes polisacáridos. Los polisacáridos capsulares producidos por las bacterias, de hecho, son de varios tamaños. De hecho, las capsulas de E. coli, que constituyen la capa protectora más externa de la superficie de la célula, se clasifican en cuatro grupos basados en criterios genéticos y biosintéticos. La cápsula del grupo II es uno de los 4 tipos capsulares descritos en E. coli, y está constituido por polímeros polisacarídicos de alto peso molecular y cargados producidos por las bacterias Escherichia coli más uropatógenas (UPEC) y otras bacterias E. coli extraintestinales. Las cápsulas del grupo II presentan una organización genética modular conservada caracterizada por 3 regiones funcionales. La región 1 (kpsFEDCUS) y la región 3 (kpsMT) están conservadas en todas las bacterias encapsuladas del grupo II y codifican proteínas requeridas para la salida ABC-dependiente. La región 2 codifica una diversidad de componentes estructurales polisacarídicos tales como los serotipos capsulares K1, K2 (CFT073), K5 y K96 (Whitfield, 2006; Whitfield y Roberts, 1999). También se han descrito cápsulas del tipo del grupo II en Haemophilus influenzae y en Neisseria meningitidis (Roberts, 1996).

En una realización preferida de la invención, un polisacárido capsular soluble del tipo del grupo II se obtiene en el sobrenadante de un cultivo de bacterias seleccionadas entre Escherichia coli, Haemophilus influenzae y Neisseria meningitidis. Sin embargo, en el presente texto, la frase "polisacáridos capsulares del tipo del grupo II" puede designar polisacáridos capsulares que se producen por otras bacterias, siempre que conserven las propiedades anti-biopelícula observadas para los polisacáridos capsulares producidos por las cepas mencionadas anteriormente. Por ejemplo, los polisacáridos capsulares producidos por la cepa 47 de la colección ECOR (Ochman y Selander, 1984) se consideran aquí como un "polisacárido capsular del tipo del grupo II", aunque esta cepa produce aparentemente una cápsula híbrida de grupo II/grupo III.

La presente invención puede llevarse a cabo con polisacáridos que tienen diferentes niveles de purificación. Por ejemplo, el sobrenadante bruto de un cultivo bacteriano (separado de las bacterias por esterilización por filtración o centrifugación) puede usarse de acuerdo con la invención como una composición que comprende polisacáridos capsulares solubles del tipo del grupo II. Sin embargo, con el fin de incrementar la actividad anti-biopelícula de la composición, así como su seguridad, el polisacárido capsular soluble del tipo del grupo II puede obtenerse como una fracción purificada. En la parte experimental proporcionada más adelante se describen tres niveles de purificación como ejemplos no limitantes. Alternativamente, una composición según la invención puede obtenerse directamente a partir del cultivo bacteriano, por ejemplo después de la lisis de las bacterias.

Otro objeto de la presente invención es una composición para inhibir la adhesión bacteriana y/o el desarrollo de biopelículas bacterianas, que comprende un polisacárido capsular soluble del tipo del grupo II procedente de una cepa bacteriana. Tal composición puede comprender polisacáridos que tienen diferentes niveles de purificación. En una realización preferida, tal composición comprende una...

1. Uso de un polisacárido capsular soluble del tipo del grupo II procedente de una cepa bacteriana, para la preparación de una composición que previene o inhibe la adhesión bacteriana y/o el desarrollo de biopelículas bacterianas.

2. El uso de la reivindicación 1, en el que dicho polisacárido capsular soluble del tipo del grupo II se obtiene en el sobrenadante de un cultivo de bacterias seleccionadas entre Escherichia coli, Haemophilus influenzae y Neisseria meningitidis.

3. El uso de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que dicho polisacárido capsular soluble del tipo del grupo II se obtiene como una fracción purificada.

4. Una composición para inhibir la adhesión bacteriana y/o el desarrollo de biopelículas bacterianas, caracterizada por que comprende un polisacárido capsular soluble del tipo del grupo II procedente de una cepa bacteriana.

5. La composición de la reivindicación 4, que comprende una fracción purificada del sobrenadante de un cultivo de bacterias seleccionadas entre E. coli, H. influenzae y N. meningitidis.

6. Un proceso para purificar un polisacárido capsular del tipo del grupo II anti-biopelícula a partir de una cepa bacteriana, que comprende los siguientes pasos:

7. El proceso de la reivindicación 6, en el que dicha cepa bacteriana que expresa una cápsula del tipo del grupo II se selecciona entre E. coli, H. influenzae y N. meningitidis.

8. El proceso de la reivindicación 6 o la reivindicación 7, en el que dicha cepa bacteriana es una E. coli uropatógena.

9. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones de 6 a 8, en el que la separación en el paso (i) se realiza por esterilización por filtración y/o por centrifugación del cultivo.

10. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en el que la precipitación en el paso (ii) se realiza con tres volúmenes de etanol por un volumen de sobrenadante.

11. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones de 6 a 10, en el que el precipitado obtenido en el paso (ii) se resuspende en agua, se dializa frente a agua desionizada, y luego se liofiliza antes del paso (iii).

12. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11, que comprende además un paso adicional (iv) de purificación por cromatografía de intercambio iónico.

13. El proceso de la reivindicación 12, en el que el paso (iv) se realiza usando una columna de DEAE-Sepharose.

14. El proceso de la reivindicación 12 o la reivindicación 13, en el que la resuspensión en el paso (iii) se hace en TrisHCl 20 mM, pH 7,5, con un 25% de propanol-1, y la columna que se usa en el paso (iv) se equilibra con el mismo tampón.

15. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en el que se realiza un paso de centrifugación entre el paso (iii) y el paso (iv) para descartar la fracción insoluble.

16. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, en el que dichos polisacáridos capsulares del tipo del grupo II se eluyen con NaCl 300 mM en TrisHCl 20 mM, pH 7,5, y 25% de propanol-1.

17. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o la composición de la reivindicación 4 o 5, en el que dicho polisacárido capsular soluble del tipo del grupo II se obtiene a través de un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 16.

18. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 4, 5 y 17, que se formula para la administración preventiva o terapéutica a un sujeto que lo necesita.

19. Un revestimiento anti-biopelícula, caracterizado por que comprende un polisacárido capsular del tipo del grupo II de una cepa bacteriana.

20. El revestimiento anti-biopelícula de la reivindicación 19, caracterizado por que dicho polisacárido capsular soluble del tipo del grupo II procede de una cepa bacteriana seleccionada entre Escherichia coli, Haemophilus influenzae y Neisseria meningitidis.

21. El revestimiento anti-biopelícula de la reivindicación 19 o de la reivindicación 20, caracterizado por que se ha obtenido por aplicación de una composición de una cualquiera de las reivindicaciones 4, 5 o 17.

22. Un dispositivo medico o industrial, caracterizado por que está revestido al menos parcialmente con un revestimiento anti-biopelícula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 19, 20 y 21.