UN METODO PARA LA PRODUCCION DE PLANTAS CON FOTORRESPIRACION SUPRIMIDA Y FIJACION DE CO2 MEJORADA.

Un método para la producción de plantas con la fotorrespiración suprimida y la fijación de CO2 mejorada que comprende introducir en una célula vegetal,

un tejido vegetal o una planta uno o más ácidos nucleicos que codifican polipéptidos que tienen las actividades enzimáticas de (i) la glicolato oxidasa o la glicolato deshidrogenasa, (ii) la glioxilato carboligasa y (iii) la semialdehído tartrónico reductasa, donde la introducción de uno o varios ácidos nucleicos da como resultado la expresión de novo de polipéptidos que tienen las actividades enzimáticas de (i) la glicolato oxidasa o la glicolato deshidrogenasa, (ii) la glioxilato carboligasa y (iii) la semialdehído tartrónico reductasa y donde dichos polipéptidos se localizan en los cloroplastos de la planta producida

Un método para la producción de plantas con fotorrespiración suprimida y fijación de CO₂ mejorada.

La invención se refiere a un método para la producción de plantas con la fotorrespiración suprimida y con una fijación de CO₂ mejorada.

Recientemente se han realizado muchos esfuerzos para mejorar el crecimiento y la resistencia de las plantas de cultivo. Algunas de las plantas de cultivo más importantes p. ej., arroz, trigo, cebada, patata, pertenecen a las plantas denominadas C₃. Solamente unas pocas plantas de cultivo importantes, como el maíz y la caña de azúcar, son plantas C₄. La fijación de CO₂ en las plantas C₃ es catalizada principalmente por la enzima ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa (RUBISCO) que está localizada en el interior de los cloroplastos. La enzima RUBISCO cataliza dos reacciones: la carboxilación y la oxigenación de la ribulosa-1,5-bisfosfato. El producto de la primera reacción son dos moléculas de 3-fosfoglicerato que entran en el ciclo de Calvin para formar almidón y ribulosa-1,5-bisfosfato. Los productos de la reacción de la oxigenasa son una molécula de 3-fosfoglicerato y una de fosfoglicolato (Goodwin y Mercer, 1983). La última se convierte en 3-fosfoglicerato en una ruta biosintética denominada fotorrespiración (véase la Figura 1). En el transcurso de esta secuencia compleja de reacciones se libera una molécula de CO₂ y se pierde de la planta. Esta pérdida de CO₂ reduce la formación de azúcares y polisacáridos en la planta y de este modo reduce su productividad. Además, se libera NH₃ que debe ser fijado de nuevo. Estos efectos se exacerban adicionalmente cuando las plantas se desarrollan con un suministro de agua subóptimo. Aquí, los estomas de la hoja se cierran y las concentraciones de oxígeno intercelular aumentan debido al oxígeno molecular liberado de las reacciones lumínicas de la fotosíntesis. Se producen elevadas cantidades de fosfoglicolato que entran en el ciclo fotorrespiratorio. Se ha estimado que las plantas pierden aproximadamente 25% del carbono ya fijado debido a la fotorrespiración. No obstante, este ciclo es absolutamente intrínseco para todas las plantas C₃ debido a la actividad oxigenasa de la RUBISCO (Leegood et al., 1995; Tolbert, 1997).

La importancia de la fotorrespiración para el crecimiento y rendimiento de la planta ha sido demostrada mediante numerosos experimentos en los que se ha aumentando artificialmente la concentración de CO₂ atmosférico en experimentos en invernadero. Ya se han observado incrementos drásticos en el comportamiento de numerosas especies de cultivo cuando se dobla la concentración de CO₂ (Kimball, 1983; Arp et al., 1998). Sin embargo, este enfoque no es aplicable a las enormes áreas utilizadas para la producción agrícola.

Las plantas C₄ han desarrollado un mecanismo para evitar estas pérdidas. Han empleado enzimas ya presentes en sus antepasados C₃, pero cambiando el grado de expresión así como la localización a nivel subcelular y específico del tipo de célula. Al separar la fijación de carbono primaria y secundaria en dos tejidos diferentes, incrementan drásticamente la concentración local de CO₂ en el sitio de actividad de RUBISCO. En resumen, tiene lugar la primera fijación de CO₂ en el citoplasma de las células del mesófilo y es catalizada por PEPC, una enzima sin actividad oxigenasa intrínseca y una afinidad significativamente mayor por su sustrato en comparación con RUBISCO. El ácido C₄ resultante se difunde al haz vascular estanco y aquí se descarboxila para liberar CO₂. El ácido monocarbónico restante sirve para regenerar el aceptor de CO₂ primario en el mesófilo. Este mecanismo de concentración de CO₂ da como resultado una completa supresión de la fotorrespiración y una fotosíntesis insensible al oxógeno (Kanai y Edwards, 1999). Un mecanismo similar con una separación temporal en lugar de espacial de las actividades enzimáticas se aplica a las plantas con un metabolismo ácido de crasuláceas (CAM) (Cushman y Bohnert, 1999).

Además de estos mecanismos dependientes de la cooperación de dos tipos de células diferentes algunas plantas acuáticas han desarrollado mecanismos de tipo C₄ que funcionan dentro de una célula. Aquí, la fijación de CO₂ primaria y secundaria tiene lugar en una célulal,pero en diferentes compartimentos. Mientras la actividad de PEPC está restringida al citoplasma, la liberación de CO₂ y la refijación similar a las plantas C₄ tiene lugar en el cloroplasto. Esta ruta de tipo C₄ unicelular da como resultado una supresión parcial de la fotorrespiración con una reducción de la sensibilidad al oxígeno (Reiskind et al., 1997).

Se han descrito numerosos intentos para transferir las rutas C₄ o de tipo C₄ o componentes de esta ruta a plantas C₃. En su mayor parte, se ha utilizado hasta ahora la expresión en exceso de PEPC. Tres grupos aplicaron la expresión del ADNc o el gen de PEPC de maíz bajo el control de diferentes promotores (Hudspeth et al., 1992; Kogami y otros, 1994; Ku y otros, 1999; Aunque se detectaron incrementos en los niveles de actividad de PEPC de hasta 100 veces con el gen de maíz intacto completo en arroz (Ku et al., 1999), sólo hubo impactos débiles sobre la fisiología y el comportamiento de crecimiento de la planta (Matsuoka et al., 2001, véase también EP-A 0 874 056). Recientemente, se ha descrito la expresión en exceso de PEPC y malato deshidrogenasa de Sorghum en patata, pero en este caso los niveles de expresión fueron bajos y no se pudo observar modificación de los parámetros fotosintéticos (Beaujean et al., 2001). Gehlen et al. (1996) han expresado en exceso ADNc de PEPC de una fuente bacteriana en patata con un impacto algo menor sobre los parámetros fotosintéticos La combinación de esta enzima con la expresión en exceso adicional de una enzima NADP⁺-malica (ME) de Flaveria pringlei dirigida al cloroplasto intensificó estos efectos sin ningún impacto sobre el crecimiento o rendimiento de la planta (Lipka et al., 1999). Para arroz, se ha descrito recientemente que la expresión en exceso de una fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (PCK) de Urochloa panicoides dirigida a cloroplastos da como resultado la inducción de PEPC endógena y el establecimiento de un ciclo semejante a C₄ en una sola célula. No obstante, no se observó un aumento de los parámetros de crecimiento (Suzuki et al., 2000; véase también WO 98/35030).

Por lo tanto, a pesar de los numerosos intentos para mejorar la fijación de CO₂ y reducir la fotorrespiración hasta ahora no se ha proporcionado ningún método que conduzca a una mejora del crecimiento, productividad, y/o rendimiento para las plantas de cultivo agrícolas. Todos estos intentos tenían el objetivo de concentrar CO₂ en el sitio de fijación para suprimir la actividad oxigenasa de la RUBISCO, mientras la presente invención tenían el objetivo de utilizar los productos de la actividad oxigenasa de la RUBISCO para la supresión de la fotorrespiración.

Muchas bacterias han desarrollado rutas bioquímicas para metabolizar glicolato, el producto primario de la actividad oxigenasa de la RUBISCO. Para Escherichia coli, esta ruta ha sido descrita con gran detalle (Lord, 1972; Pellicer et al., 1996). E. coli es capaz de crecer sobre glicolato como única fuente de carbono. Como se resume en la Figura 4, el glicolato se oxida primero a glioxilato. Esta reacción es provocada por un complejo multiproteico que es capaz de oxidar el glicolato de una manera independiente del oxígeno. Las proteínas necesarias para la oxidación del glicolato en E. coli han sido analizadas y se ha demostrado que los marcos de lectura abiertos D, E, y F del operón de la glicolato oxidasa glc están codificando los componentes de la enzima activa. En la siguiente etapa de reacción, dos moléculas de glioxilato son ligadas por la glioxilato carboligasa (GCL) para formar semialdehído tartrónico (TS) y en esta reacción se libera CO₂. El TS es convertido adicionalmente en glicerato por la TS reductasa (TSR). El glicerato es integrado en el metabolismo del carbono basal bacteriano.

También se aplica una ruta similar como ciclo fotorrespiratorio en algunas algas verdes y cianobacterias (Nelson y Tolbert, 1970; Ramazanov y Cardenas, 1992). En este caso, la oxidación del...

1. Un método para la producción de plantas con la fotorrespiración suprimida y la fijación de CO₂ mejorada que comprende introducir en una célula vegetal, un tejido vegetal o una planta uno o más ácidos nucleicos que codifican polipéptidos que tienen las actividades enzimáticas de (i) la glicolato oxidasa o la glicolato deshidrogenasa, (ii) la glioxilato carboligasa y (iii) la semialdehído tartrónico reductasa, donde la introducción de uno o varios ácidos nucleicos da como resultado la expresión de novo de polipéptidos que tienen las actividades enzimáticas de (i) la glicolato oxidasa o la glicolato deshidrogenasa, (ii) la glioxilato carboligasa y (iii) la semialdehído tartrónico reductasa y donde dichos polipéptidos se localizan en los cloroplastos de la planta producida.

2. El método de la reivindicación 1, donde dichos polipéptidos comprenden una secuencia de aminoácidos que dirige dichos polipéptidos al cloroplasto.

3. El método de la reivindicación 1 ó 2 donde dichos polipéptidos que tienen la actividad enzimática de una glicolato oxidasa se obtienen del operón glc de E. coli.

4. El método de la reivindicación 3, donde dichos polipéptidos comprenden la secuencia de aminoácidos de los SEQ ID NO: 2, 4 y 6.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde dichos ácidos nucleicos comprenden la secuencia de polinucleótidos de los SEQ ID NO: 1, 3 y 5.

6. El método de la reivindicación 1 ó 2 donde dichos polipéptidos que tienen la actividad enzimática de una glicolato deshidrogenasa son glioxilato reductasas humanas.

7. El método de la reivindicación 6, donde dichos polipéptidos comprenden la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 8.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 6 o 7, donde dichos ácidos nucleicos comprenden la secuencia de polinucleótidos del SEQ ID NO: 7.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde dichos polipéptidos que tienen la actividad enzimática de una glioxilato carboligasa se obtienen de E. coli.

10. El método de la reivindicación 9, donde dichos polipéptidos comprenden la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 12.

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde dichos ácidos nucleicos comprenden la secuencia de polinucleótidos del SEQ ID NO: 11.

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, donde dichos polipéptidos que tienen la actividad enzimática de una semialdehído tartrónico reductasa se obtienen de E. coli.

13. El método de la reivindicación 12, donde dichos polipéptidos comprenden la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 14.

14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, donde dichos ácidos nucleicos comprenden la secuencia de polinucleótidos del SEQ ID NO: 13.

15. Una célula vegetal, tejido vegetal o planta que comprende uno o más ácidos nucleicos que codifican polipéptidos que tienen las actividades enzimáticas de (i) la glicolato oxidasa o la glicolato deshidrogenasa, (ii) la glioxilato carboligasa y (iii) la semialdehído tartrónico reductasa, donde dichos polipéptidos se localizan en los cloroplastos.

16. La célula vegetal, tejido vegetal o planta de la reivindicación 15, donde dichos polipéptidos comprenden una secuencia de aminoácidos que dirige dichos polipéptidos al cloroplasto.

17. La célula vegetal, tejido vegetal o planta de la reivindicación 15 o 16 donde dichos polipéptidos que tienen la actividad enzimática de una glicolato oxidasa se obtienen del operón glc de E. coli.

18. La célula vegetal, tejido vegetal o planta de la reivindicación 17, donde dichos polipéptidos comprenden la secuencia de aminoácidos de los SEQ ID NO: 2, 4 y 6.

19. La célula vegetal, tejido vegetal o planta de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, donde dichos ácidos nucleicos comprenden la secuencia de polinucleótidos de los SEQ ID NO: 1, 3 y 5.

20. La célula vegetal, tejido vegetal o planta de las reivindicaciones 15 o 16, donde dichos polipéptidos que tienen la actividad enzimática de una glicolato deshidrogenasa son glioxilato reductasas humanas.

21. La célula vegetal, tejido vegetal o planta de la reivindicación 20, donde dichos polipéptidos comprenden la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 8.

22. La célula vegetal, tejido vegetal o planta de una cualquiera de las reivindicaciones 15,16, 20 o 21, donde dichos ácidos nucleicos comprenden la secuencia de polinucleótidos del SEQ ID NO: 7.

23. La célula vegetal, tejido vegetal o planta de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 22, donde dichos polipéptidos que tienen la actividad enzimática de una glioxilato carboligasa se obtienen de E. coli.

24. La célula vegetal, tejido vegetal o planta de la reivindicación 23, donde dichos polipéptidos comprenden la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 12.

25. La célula vegetal, tejido vegetal o planta de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 24, donde dichos ácidos nucleicos comprenden la secuencia de polinucleótidos del SEQ ID NO: 11.

26. La célula vegetal, tejido vegetal o planta de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 25, donde dichos polipéptidos que tienen la actividad enzimática de una semiladehído tartrónico reductasa se obtienen de E. coli.

27. La célula vegetal, tejido vegetal o planta de la reivindicación 26, donde dichos polipéptidos comprenden la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 14.

28. La célula vegetal, tejido vegetal o planta de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 27, donde dichos ácidos nucleicos comprenden la secuencia de polinucleótidos del SEQ ID NO: 13.